万学瑞
- 作品数：51 被引量：186H指数：7
- 供职机构：甘肃农业大学动物医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金甘肃省自然科学基金甘肃省科技计划项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学文化科学医药卫生更多>>
- 鸡Prnp基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达
- 2020年
- 试验旨在构建鸡Prnp基因原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,为制备鸡朊蛋白单克隆抗体提供材料。根据GenBank已报道的鸡Prnp基因组序列和pET-28a质粒多克隆位点设计引物,以健康的鸡全血基因组DNA为材料,采用PCR的方法扩增鸡的Prnp基因,将目的基因片段与pET-28a载体连接,构建重组原核表达载体。重组菌转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)进行诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定表达的重组蛋白。结果表明,重组蛋白在诱导剂的终浓度为0.08 mmol·L^-1,16℃,220 r·min^-1诱导7 h,蛋白表达量最高。综上所述,本研究成功构建了pET-28a-Ch Prnp重组表达菌株,为Prnp朊蛋白的结构、生理功能和致病机制研究提供方法。
- 李仙春芦艳毛耀芳杨海峰余海山马永华万学瑞
- 关键词：重组表达载体原核表达
- 腾冲嗜热厌氧杆菌tte0732基因的表达及生物信息学分析被引量：4
- 2018年
- 腾冲嗜热厌氧杆菌tte0732(Galu)基因编码的TTE0732是温度依赖性蛋白。为研究其在热适应中的作用,应用PCR技术克隆腾冲嗜热厌氧菌tte0732基因,构建原核表达载体pET-28a::tte0732并在大肠埃希菌BL21表达TTE0732;通过qRT-PCR分析tte0732基因在50、60、75和80℃的RNA表达量;应用生物信息学软件分析Galu在嗜热菌和常温菌中编码氨基酸的基本理化性质。成功构建了原核表达载体pET-28a::tte0732并在大肠埃希菌BL21中得到高效表达,TTE0732分子质量大小为35 ku,主要以可溶性形式存在;qRT-PCR显示tte0732 mRNA在75和80℃高表达;生物信息学分析得出tte0732基因完整的ORF全长909 bp,编码302个氨基酸,其中Ile(I)、Leu(L)含量高于常温菌,编码蛋白为酸性亲水性蛋白,等电点为5.22,含有18个潜在的磷酸化位点,不存在跨膜结构、信号肽和糖基化位点。预测其蛋白质二级空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主。腾冲嗜热厌氧杆菌TTE0732蛋白是一种亲水性蛋白,在原核系统能高效表达,本研究结果对嗜热蛋白质的热稳定性机制的研究具有一定的参考。
- 刘原子王艳王川吴润万学瑞吴自祥
- 关键词：腾冲嗜热厌氧菌原核表达生物信息学分析QRT-PCR
- 牛瘤胃纤维素酶eg基因在乳酸菌中的克隆表达及酶学性质分析被引量：2
- 2021年
- 为构建高效表达的内切葡聚糖酶基因工程菌,本研究以牛瘤胃液中微生物全基因组为模板,通过PCR扩增方法得到eg片段,将其克隆至表达载体pMG36e中获得分泌型表达载体pMG36e::eg;将测序正确后的重组质粒电转导到乳酸菌(Lactococcus lactis NZ9000)中,得到L.lactis NZ9000/pMG36e::eg重组菌株,将发酵上清液通过10%三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)/丙酮沉淀法浓缩蛋白后,用刚果红染色法和3,5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)法检测该蛋白酶活性,使用滤纸酶活力(filter paper enzyme activity,FPA)法检测该蛋白酶的总酶活,并对重组内切葡聚糖酶进行酶学性质研究。结果表明:从牛瘤胃微生物中克隆得到一个基因大小为1500 bp左右的条带,该酶分子量为50 kDa左右,经刚果红染色有明显水解圈,水解圈直径为2.32 cm;采用DNS法测定该重组蛋白的酶活为12.4019 U·mL^(−1),用FPA法测定总酶活为12.2469 U·mL^(−1);重组蛋白酶对羧甲基纤维素钠、滤纸、微晶纤维素、脱脂棉均有酶活性;最适反应温度为90℃;最适反应pH为6;其中Cu^(2+)、Mn^(2+)、Ba^(2+)、Zn^(2+)、Co^(2+)等均可以提高重组酶的酶活力,而Fe^(2+)可抑制重组内切葡聚糖酶活力。本试验纤维素酶eg基因在L.lactis NZ9000中的稳定高效表达为提高青贮饲料的营养价值和消化率提供了技术支持。
- 邹爱爱魏亚琴杨宇泽曹磊孙康永杰万学瑞王川
- 关键词：内切葡聚糖酶乳酸菌酶学性质
- 武威驴PrP基因序列与结构特征的分析
- 2015年
- 以武威驴朊蛋白(PrP)基因序列与结构特征分析为基础,通过比对找到奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因的差异,探究朊病毒病在奇蹄动物与偶蹄动物之间传播的种间屏障及其形成机制。分别从8头武威驴全血中提取基因组总DNA,用设计的特异性引物以聚合酶链反应扩增出细胞型朊蛋白基因(PrPC),并将其克隆到pGEM-T Easy载体。测序之后使用生物信息学方法与软件进行相关分析。序列测定分析表明,所克隆的武威驴PrP基因片段的大小为768bp,包含了驴PrP基因的完整编码区序列,为包含在单一外显子内的完整开放阅读框。本次克隆的武威驴PrP基因含5个短而富含G-C的元件,可编码九肽/八肽PQGGGGWGQ/PHGGGWGQ重复子。8个驴PrP基因之间核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性分别介于99.2%~99.8%和98.4%~100%之间。武威驴与西吉驴、马之间PrP基因序列的同源性分别为99.2%和98.7%,与牛、绵羊、马之间PrP基因C端约100个残基区域的三级结构的相似性分别为91.84%、92.04%和97.35%。结果表明,奇蹄动物与偶蹄动物之间PrP基因存在明显的差异与进化分歧。
- 张天亮吴润杨润霞魏姣万学瑞刘霞刘磊张小丽
- 关键词：偶蹄动物
- 实时荧光定量PCR构建牛源粪肠球菌esp标准曲线
- 2019年
- 为了快速检测牛源粪肠球菌,本实验建立了粪肠球菌esp基因实时荧光定量PCR标准曲线。首先参照esp基因在Genbank中的序列进行引物的设计与合成,利用PCR扩增目的基因并将其连接到pMD18-T载体上,并转化进入大肠埃希菌TOP10感受态细胞,经测序鉴定成功后,提取重组质粒并以10倍系列稀释后作为标准模板,进行实时荧光定量PCR。成功建立了牛源粪肠球菌esp基因荧光定量PCR标准曲线及其直线回归方程,所得熔解曲线峰值单一,表明引物具有很好的特异性;标准曲线相关系数r^2=0.9998,说明线性关系良好,目的基因的荧光定量PCR的标准曲线构建成功。本研究为快速检测牛源粪肠球菌奠定了基础。
- 樊杰孙康永杰魏亚琴杨宇泽万学瑞丁巨财王川
- 关键词：粪肠球菌ESP实时荧光定量PCR
- 鸡PrP基因真核表达载体的构建及其在毕赤酵母GS115中的表达被引量：1
- 2015年
- 为构建鸡PrP基因的真核表达载体,并通过毕赤酵母表达系统获得鸡朊蛋白（ChPrP）,根据毕赤酵母GS115的密码子偏好性、G＋C含量等特点对目的基因PrP（25～248）进行密码子优化与基因合成,同时以特异性引物扩增获得天然未经密码子优化的目的片段,之后将两种目的片段分别连接于pPIC9K表达载体并转化至毕赤酵母GS115中,经PCR,选择培养基MM、MD方法鉴定表型后以甲醇进行诱导获得目的蛋白,最后以SDS-PAGE检测蛋白表达。结果显示,经PCR及双酶切鉴定,成功构建了真核表达重组载体pPIC9K-PrP（25～248）,并在毕赤酵母GS115中获得鸡朊蛋白,其与未经密码子优化的目的蛋白相比,具有更高的表达量。本研究通过毕赤酵母表达系统成功获得了鸡朊蛋白,为后续研究奠定了基础,也通过密码子优化前后蛋白表达量比对,再一次证实毕赤酵母具有较高的密码子偏好性。
- 张天亮吴润杨润霞魏姣万学瑞刘霞刘磊张小丽
- 关键词：PPIC9K毕赤酵母GS115真核表达
- 优良抑菌活性乳酸菌对玉米青贮及有氧暴露期微生物数量和pH的影响被引量：37
- 2016年
- 为了探讨乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量及其pH的影响,进一步筛选出可提高青贮饲料品质和有氧稳定性的乳酸菌接种剂,将实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离筛选获得的5株产酸快、多且具有抑菌活性的优良乳酸菌分别添加全株玉米进行青贮,分析青贮过程和有氧暴露后青贮饲料中乳酸菌、好氧细菌、酵母菌和霉菌数量的动态变化及pH。结果显示,在青贮过程和有氧暴露后,分别添加肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳杆菌B3-1、屎肠球菌B5-2和发酵乳杆菌E2-3的各处理组乳酸菌总数均显著高于对照组,而好氧细菌、酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组,pH亦低于对照组。其中B1-7和B5-2处理组在青贮初期乳酸菌总数最多,从青贮第7天开始到有氧暴露的30d内,始终是B3-1处理组乳酸菌总数最多,好氧细菌、酵母菌和霉菌数量最少、pH最低。以上结果表明这5株乳酸菌具有提高青贮饲料品质和有氧稳定性的潜力,其中植物乳杆菌B3-1的效果最好。
- 万学瑞吴建平雷赵民何轶群吴润
- 关键词：全株玉米青贮PH
- 动物医学专业预防兽医学实验Ⅰ教学改革探讨被引量：3
- 2015年
- 预防兽医学实验Ⅰ包括兽医微生物学和兽医免疫学实验,这两门课程都是实验性很强的学科,加强实验教学对于培养学生的综合素质和创新能力具有重要意义.本文从优化实验教学条件、改革实验教学内容、改进实验教学模式、规范实验报告格式和构建试验考核体系五个方面,提出了预防兽医学实验Ⅰ教学改革的一些具体措施.
- 万学瑞刘磊吴润张小丽刘岗
- 关键词：兽医微生物学教学改革
- 复合乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后微生物及饲料品质的影响被引量：19
- 2020年
- 为探讨不同复合乳酸菌对全株玉米青贮及有氧暴露后青贮饲料中微生物数量及其发酵品质的影响,进一步筛选出可提高青贮饲料品质和有氧稳定性的复合乳酸菌接种剂,共设置3个不同组合乳酸菌分别添加全株玉米进行青贮,并设空白对照,测定青贮3、7、15和30 d,开袋有氧暴露1、3、7、15和30 d时微生物数量、发酵品质和营养成分的变化情况。结果表明,分别添加异型乳酸菌组合(Hetero)、同型乳酸菌组合(Homo)和同型+异型乳酸菌组合(Homo+Hetero)的各处理组均能有效地增加青贮过程和有氧暴露后饲料中乳酸菌的数量、乳酸(LA)和乙酸(AA)的含量,减少好氧细菌、酵母菌和霉菌数量,降低pH和氨态氮(NH 3-N)含量,减少粗蛋白(CP)损失,显著改善青贮饲料发酵品质,抑制青贮饲料有氧暴露后的二次发酵,其中Homo+Hetero效果最好,Homo处理组好于Hetero处理组。
- 万学瑞豆思远李玉何轶群王川张小丽雷赵民
- 关键词：全株玉米微生物数量青贮品质
- 5株优良抑菌活性乳酸菌对全株玉米青贮品质的影响被引量：19
- 2017年
- 为了探讨具有优良抑菌活性的乳酸菌对全株玉米青贮过程不同时期营养品质的影响,进一步验证并筛选出可提高玉米秸秆青贮品质的乳酸菌接种剂,将实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离筛选获得的5株产酸快、多,且具有抑菌活性的优良乳酸菌分别添加到全株玉米秸秆中进行青贮,共设置6个试验组,分别在青贮第3、7、15、30天测定产物的干物质(DM)、粗蛋白(CP)、可溶性碳水化合物(WSC)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和氨态氮(NH3-N)含量及第30天乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)含量。结果显示,发酵30d后,5个处理组的DM、CP、ADF和LA含量显著高于对照组(P<0.05),NH3-N和WSC含量显著低于对照组(P<0.05),B3-1组NDF显著高于对照组(P<0.05),但与其他处理组差异不显著(P>0.05),B3-1和B5-2组AA含量显著高于对照组(P<0.05),但与其他处理组差异不显著(P>0.05);各组DM、CP、WSC含量均随发酵时间延长而降低,而ADF、NDF和NH_3-N含量均随发酵时间的延长而升高;B3-1组在玉米秸秆全株青贮发酵各期的发酵品质和营养品质最优。以上结果表明5株乳酸菌均能显著改善青贮饲料发酵品质,其中植物乳杆菌B3-1的效果最好。
- 雷赵民王建福吴建平何轶群吴润姜辉万学瑞
- 关键词：全株玉米营养品质发酵品质
