张凤娟
- 作品数：4 被引量：4H指数：1
- 供职机构：苏州大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国防科技工业技术基础科研项目江苏省卫生厅面上基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- Ad-hOSM转基因饲养层细胞对脐血CD34^+造血干/祖细胞增殖及归巢能力的影响
- 2011年
- 目的:建立转人抑瘤素M(hOSM)基因腺病毒载体的饲养层细胞,观察转基因细胞对脐血CD34+造血干/祖细胞扩增的影响,比较扩增前、后造血干/祖细胞体外迁移能力的变化。方法:建立转hOSM基因腺病毒载体的饲养层细胞,并用RT-PCR法和ELISA法鉴定目的基因;采用免疫磁珠法分离脐带血CD34+造血干/祖细胞,流式细胞术(FCM)检测纯度;将CD34+造血干/祖细胞与饲养层细胞共培养,FCM检测各组增殖效果;扩增后的造血干/祖细胞用跨膜迁移实验(Transwell实验)检测自发迁移率和SDF-1诱导迁移率以鉴定体外扩增的造血干/祖细胞的归巢能力。结果:建立的转基因饲养层细胞均有绿色荧光,RT-PCR法和ELISA法证实有目的基因表达,免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干/祖细胞纯度可达(96.8±2.28)%,与Ad-hOSM转基因饲养层细胞共培养7 d后CD34+造血干/祖细胞可扩增15.73倍,表面黏附分子CXCR4和CD54表达量仍较高,培养后的细胞用Tran-swell板做体外迁移实验,与转基因饲养层细胞共培养的干细胞,其诱导迁移率为(40.68±1.35)%,明显高于对照组,可以较好的保持其归巢能力。结论:转hOSM基因腺病毒载体的饲养层细胞可有效扩增脐血CD34+造血干/祖细胞,延缓其分化,并且体外扩增后仍保持较高的归巢能力。
- 田丽娜郁心包婉蓉陈瑶韩亚丽张凤娟缪竞诚
- 关键词：腺病毒载体
- 腺病毒介导的人抑瘤素M基因对A375人黑色素瘤细胞的抑制作用被引量：1
- 2011年
- 目的:构建抑瘤素M(OSM)重组腺病毒载体,研究其对人黑色素瘤细胞A375的抑制作用。方法:以PEGZ-OSM重组质粒为模板,通过PCR技术扩增出OSM片段,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人OSM氨基酸序列相同的重组腺病毒子Ad-OSM,感染A375细胞,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot法检测OSM在A375细胞中的转录和表达;荧光显微镜观察A375细胞的形态学改变;MTT法和流式细胞术(FCM)检测Ad-OSM对A375细胞的生长抑制和细胞周期的抑制效应;半定量RT-PCR法检测OSM基因表达对A375细胞中的Bax、Bcl-2基因表达的影响。结果:基因测序和PCR分析结果显示,成功构建了Ad-OSM腺病毒表达载体;RT-PCR和Western blot法检测到OSM基因在A375细胞中的转录和表达;OSM基因的表达对A375细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,OSM基因可通过上调细胞中Bax和下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡。结论:成功构建了Ad-OSM腺病毒表达载体,感染OSM基因可明显抑制A375人黑色素瘤细胞的生长,诱导其凋亡,该现象可能是通过改变Bax、Bcl-2基因表达水平来发挥抗肿瘤作用。
- 张凤娟杨吉成盛伟华王家融缪竞诚
- 关键词：腺病毒载体黑色素瘤凋亡
- IRES/polyA-promoter介导的Ang-1与VEGF165双基因表达效率的对比分析被引量：2
- 2010年
- 目的：构建IRES及polyA-promoter介导人血管生成素-1（Angiogenin-1,Ang-1）和人血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor165,VEGF165）双基因共表达的腺病毒载体,比较IRES与polyA-promoter不同表达模式及其对位于二者前后基因的表达效率和诱导兔角膜新生血管的形成功能,为今后构建双基因或多基因高效共表达载体提供实验依据。方法：以pAdTrack-CMV-Ang-1-IRES-VEGF165质粒为模板,PCR扩增人VEGF165及Ang-1基因片段,分别将其亚克隆至改建的pAdTrack-CMV-PolyA-promoter及pAdTrack-CMV-IRES转移质粒中,构建pTrack-CMV-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165、pTrack-CMV-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1、pTrack-CMV-VEGF165-IRES-Ang-1基因重组转移质粒,再与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中同源重组,然后经PacI线性化后转染QBI-293A人胚肾成纤维细胞（简称293A细胞）,收获腺病毒重组病毒子Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165及Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165在QBI-293A细胞中的转录,ELISA法分别检测不同腺病毒载体目的基因的表达量,比较分析Ang-1与VEGF165基因在IRES和polyA-promoter介导的不同腺病毒表达载体中的表达能力,及在同一腺病毒表达载体中前后不同位置的表达效率。并进一步于兔角膜缘注射Ad-Ang-1-polyA-promoter-VEGF165,Ad-VEGF165-polyA-promoter-Ang-1,Ad-VEGF165-IRES-Ang-1,Ad-Ang-1-IRES-VEGF165,检测角膜新生血管的面积,并比较其诱导血管形成能力的差异。结果：测序显示Ang-1和VEGF165序列正确,不同重组腺病毒载体均获得成功包装,病毒效价可达2~5×1010pfu/m l,RT-PCR检测Ang-1和VEGF165均能有效转录,ELISA法检测结果表明Ang-1、VEGF165基因不仅均能在细胞中有效表达,而且IRES介导的Ang-1及VEGF165基因,无论在IRES上游或下游,其表达量均低于polyA-promoter相同位置的Ang-1及VEGF165基因表达量,大约降低60%~70%左右,同时Ang-1/VEGF165在同一载体上、下�
- 陈瑶缪竞诚韩亚丽盛伟华包婉蓉田丽娜张凤娟吕海涛杨吉成
- 关键词：血管生成素-1血管内皮生长因子IRES
- Ad-LIF-OSM双基因转染饲养细胞对脐血造血细胞体外增殖和分化的影响被引量：1
- 2011年
- 目的构建表达人白血病抑制因子（LIF）和抑瘤素M（OSM）双基因的WI-38人胚肺成纤维细胞，并以此细胞作为饲养层细胞观察其对CD34造血干／祖细胞体外增殖和分化的影响。方法以双启动子转移载体pAdTrack-CMV-LIF-polyA＋promoter。为基础，将OSM基因片段酶切后插入，构建出转移质粒pAdTrack-CMV-LIF-polyA＋promoter。OSM。将构建正确的转移质粒与腺病毒骨架质粒共转化，获得重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-LIF-polyA＋promoter。OSM，通过包装，收获重组腺病毒（Ad-LIF-OSM）。将重组腺病毒感染饲养层细胞，经RT．PCR、ELISA法检测外源基因在细胞中的表达；体外与CD34造血干／祖细胞共培养后，通过Transwell法和细胞计数检测，比较各实验组干／祖细胞体外扩增与分化情况。结果测序结果显示重组载体中的LIF和OSM基因序列正确；转基因饲养层细胞中能检测到外源LIF和OSM基因的转录和表达；外源LIF和OSM基因在造血干／祖细胞体外培养中能够发挥作用。结论成功构建携带人LIF和OSM的双基因重组腺病毒载体（Ad-LIF-OSM），Ad-LIF．OSM在造血干／祖细胞体外培养的过程中能够有效地扩增CD34造血干／祖细胞，并延缓其分化。
- 包婉蓉郁心盛伟华张凤娟王家融杨吉成缪竞诚
- 关键词：白血病抑制因子抑瘤素M
