张正平
- 作品数：4 被引量：25H指数：3
- 供职机构：华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划武汉市科技攻关计划项目更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达被引量：11
- 2010年
- 【目的】克隆扩展青霉脂肪酶基因,实现具强催化活性的脂肪酶的异源高效表达。【方法】利用RT-PCR扩增扩展青霉CICC 40356脂肪酶(PEL)cDNA序列,利用重叠延伸PCR(Over-lap extension PCR)技术对PEL的10个稀有氨基酸密码子和表达载体pPIC9Kα信号肽的9个氨基酸密码子进行了优化,获得了改造过的脂肪酶基因PELM和表达载体pPIC9KM。并构建了带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL1、pPIC9KM-PELM1、pPIC3.5K-PEL1、pPIC3.5K-PELM1和不带有脂肪酶自身信号肽的pPIC9K-PEL2、pPIC9KM-PELM2六个重组质粒。利用对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测工程菌脂肪酶的酶活。在此基础上,对工程菌的酶学性质进行了研究。【结果】扩展青霉脂肪酶基因cDNA序列分析结果表明该序列与已报道PEL cDNA序列仅相差3个碱基,同源性高达99%。6个重组工程菌在甲醇诱导下,均表现出pNPP水解活性,28℃诱导100h时酶活达到最高,发酵上清的酶活分别为3.65 U/mL、30.49 U/mL、90.85 U/mL、212.05 U/mL、15.29 U/mL、76.32 U/mL。SDS-PAGE结果表明重组脂肪酶分子量均约28 kDa。酶学性质研究表明,重组脂肪酶PELM最适温度为35℃,最适pH为9.5,在pH7.0-10.0范围内该脂肪酶均较稳定,Ca2+和Mg2+对其有激活作用,Fe2+、Zn2+、Cu2+则有抑制作用,EDTA能使之快速失活。以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其对中链酯(C8-C12)有较强的水解能力,最适底物为为C8的pNP酯。【结论】密码子优化后的扩展青霉脂肪酶基因在毕赤酵母中获得理想的表达,其酶活力比未优化的野生脂肪酶的提高了2.3-2.5倍,表明定点突变对其基因本身更改特有稀有密码子是实现PEL功能蛋白的异源高效表达的有效策略之一。
- 张正平杨江科徐莉刘云闫云君
- 关键词：扩展青霉脂肪酶基因克隆密码子优化
- 扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达
- 脂肪酶是一种重要的工业酶,在自然界中普遍存在,目前许多脂肪酶基因已被克隆,并获得相应高效表达的工程菌。扩展青霉脂肪酶是一种中温碱性脂肪酶,可在碱性条件下分解三酰甘油酯,在工业上有着广泛的应用。本研究以扩展青霉/(Peni...
- 张正平
- 关键词：扩展青霉脂肪酶基因克隆密码子优化
- 文献传递
- 黑曲霉(Aspergillus niger)F044脂肪酶新型基因lipB的克隆、表达及酶学性质分析被引量：5
- 2009年
- 【目的】本研究拟克隆新型的黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶(EC3.1.1.3)基因,实现其在大肠杆菌(Escherichia coli)的高效表达,并对表达产物进行系统的酶学性质分析,为该脂肪酶的工业化生产及应用奠定基础。【方法】通过PCR和RT-PCR克隆脂肪酶基因,并将其开放式阅读框(ORF)克隆入融合表达载体pET28a;表达产物经Ni-agarose纯化后对LipB进行酶学性质分析,并通过圆二色谱进行结构分析。【结果】成功地从A.nigerF044中克隆了一个新型的脂肪酶基因lipB,获得了该基因的全基因组序列和cDNA序列(GenBank:FJ536287、FJ536288),并实现了其在E.coli中的高效表达。LipB分子量约为43.0kDa,最适底物为pNPC(C8),酶学动力学常数Km=5.98mmol/L,最适反应温度为50℃,最适pH为6.0;该酶能在40℃条件下保持稳定,在60℃条件下处理1h后残余酶活仅为18.8%;该酶对Ca2+敏感,当脂肪酶经2mmol/L Ca2+处理1h后,酶活提高了2.6倍。圆二色谱分析表明,该酶在Ca2+处理前后具有明显的结构变化。【结论】新型A.niger脂肪酶lipB基因的克隆不仅积累了脂肪酶基因资源,而且为高效基因工程菌的构建及规模化应用奠定基础;对LipB的酶学性质分析表明,该酶在食品和油酯化工等领域具有广阔的应用前景。
- 杨江科张正平刘立营闫云君
- 关键词：黑曲霉脂肪酶克隆
- 二步法黑曲霉脂肪酶基因lipA的全基因合成及其在毕赤酵母中的高效表达被引量：8
- 2009年
- 黑曲霉脂肪酶是重要的工业用酶,在食品、制药等领域具有广泛的用途。获得黑曲霉脂肪酶高效表达的基因工程菌是该脂肪酶规模化应用的前提。通过全基因合成对目的基因进行分子改造和人工组建是实现基因高效表达和体外分子进化的有效手段。本研究主要针对一步法长片段基因合成中复杂结构的非特异性配对和过多的PCR引入碱基错配等问题,采用二步法(组装PCR和酶切-酶连)合成了黑曲霉脂肪酶基因lipA。首先在DNA2.0和Gene2Oliga软件辅助下对lipA基因密码子及RNA二级结构进行优化并引入ClaI(237位)和PstI(475位)酶切位点;通过组装PCR分别合成lipA基因的各片段F1(237bp)、F2(238bp)和F3(422bp);通过该基因内的ClaI和PstI限制性酶切位点连接成完整的全长lipA基因。本方法有效地降低了长片段合成过程中寡核苷酸片段的非特异性配对、复杂的二级结构以及碱基突变对DNA合成的影响,提高了长片段合成的成功率。经密码子优化后的脂肪酶基因(lipA-syn)在毕赤酵母GS115中经诱导表达72h后,发酵液酶活达176.0U/mL,蛋白质含量为143.7mg/L,较出发基因分别提高了10.8倍和5.6倍。实现了该基因的高效表达,并为产酶参数的优化和酶的规模化制备奠定了基础。
- 杨江科严翔翔张正平江雪青闫云君
- 关键词：毕赤酵母
