张海锋
- 作品数：6 被引量：14H指数：2
- 供职机构：徐州医学院更多>>
- 发文基金：辽宁省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 体外诱导人脐静脉间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究被引量：2
- 2007年
- 探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下分离的间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化的可能性,以期为脐静脉MSCs的神经移植提供理论依据。通过在无菌条件下收集正常足月剖宫产新生儿脐带并对脐静脉进行胶原酶消化,将获取的内皮及内皮下贴壁细胞进行培养。经传代培养及免疫细胞化学鉴定后,取第2代细胞用β-巯基乙醇和二甲基亚砜诱导其向神经元方向分化,并以免疫细胞化学方法对分化细胞进行鉴定。结果表明脐静脉经胶原酶消化后的贴壁细胞主要表现为间充质样细胞和内皮细胞;传2代后,间充质样细胞可得到纯化和扩增。免疫细胞化学染色显示诱导前细胞不表达血管性血友病因子(vWF),诱导后MSCs表达巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE),而不表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。以上结果提示,来源于脐静脉内皮及内皮下的MSCs在体外可以培养、扩增,并具备在诱导剂的作用下向神经元样细胞分化的潜能,可作为神经系统疾病细胞移植治疗的备选来源。
- 李德华单伟张海锋赵宝东秦书俭
- 关键词：人脐静脉间充质干细胞神经元样细胞
- 不同胚龄昆明小鼠胚胎获取胚胎干细胞体外培养的比较被引量：2
- 2010年
- 目的探讨分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的最佳胚龄。方法分别从孕3.5 d和4.5 d的母鼠子宫中分离收集桑椹胚和囊胚,比较体外培养时胚胎的贴壁率、内细胞团(inner cell mass,ICM)形成率、形成ES细胞克隆率(P1)和形成ES细胞亚克隆率(P2)。结果孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚,分离培养结果表明,后者的胚胎贴壁率、ICM形成率和ES细胞克隆形成率均高于前者,均有显著性差异(P<0.05)。结论囊胚较桑葚胚更适合作为体外分离培养昆明小鼠ES细胞的材料。
- 秦书俭张海锋单伟
- 关键词：昆明小鼠胚胎干细胞胚龄
- 不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长影响的比较被引量：5
- 2007年
- 目的:采用组织块培养法、单细胞悬液法、滤网过滤改良法分离培养鼠胚胎成纤维细胞,比较不同分离方法对其生长形态、生长曲线及细胞周期的影响。方法:实验于2006-03/09在辽宁医学院解剖实验室完成。①选取清洁级昆明种七八周龄雄性小鼠10只,4周龄雌性小鼠20只,雄雌鼠按1∶2合笼,次日晨检查有阴栓者记为孕0.5d,选择孕12.5～14.5d雌鼠断颈处死,取出胎鼠,去除胚胎头部、内脏和四肢,将躯干部用无菌眼科剪剪成1mm3以下的碎块,分别用以下方法进行分离培养。②组织块培养法:将剪碎的组织块吸置于离心管内,加入1mL消化液(含2.5g/L胰蛋白酶和0.4g/L乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液),吹吸30s,加入等体积的完全培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)终止消化,弃上清液,留下鼠胚组织块沉淀物,按相互距离0.5cm放入培养瓶内,培养箱静置2～4h后,加入适量完全培养基,3d换液一次。③单细胞悬液法:将剪碎的组织块加入1mL消化液,吹打30s,室温下静置3～5min,吸取上层液体,再加入消化液,重复上述操作五六次,最后弃组织块,将收集的上层液离心,1000r/min离心5min,弃上清液,加入完全培养基5mL,吹打均匀后吸至培养瓶内培养。培养条件、换液时间与组织块培养法相同。④滤网过滤改良法:将剪碎的组织块加入1mL消化液,吹打30s,37℃水溶箱中轻摇3～5min,加入完全培养基1mL终止消化,室温下静置1.0～2.0min,用直径5cm、孔径为150目滤网过滤后,将过滤液以1000r/min离心5min;弃上清液,加入适量完全培养基,轻吹30～50下,吸至培养瓶内,37℃、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养24h,半量换液,以后3d换液一次。⑤检测不同分离方法对鼠胚胎成纤维细胞生长形态、生长曲线及细胞周期的影响。结果:①鼠胚胎成纤维细胞生长形态观察:组织块培养法第2天可见少量成纤维细胞,细胞生长缓慢,需要七八天才能传代�
- 张海锋单伟秦书俭
- 关键词：成纤维细胞胚胎细胞分离细胞培养技术
- 血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞生长增殖的影响被引量：1
- 2009年
- 背景:在体外构建组织工程材料的过程中,快速获得足够数量且纯度高的种子细胞极为重要,但目前人脐静脉间充质干细胞原代培养的增殖率仍较低。目的:观察血管内皮细胞生长因子对人脐静脉间充质干细胞原代生长、增殖的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/07在辽宁医学院解剖学实验室完成。材料:正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由锦州市凌河区妇幼保健院及辽宁医学院附属第一医院提供。方法:采用胶原酶消化法分离人脐静脉间充质干细胞,以1×108L-1的密度接种于24孔培养板,设立2组,实验组加入150g/L血管内皮细胞生长因子,对照组不加入任何细胞因子。主要观察指标:观察细胞形态变化,MTT法检测细胞生长曲线,免疫细胞化学法鉴定细胞CD166的表达。结果:接种后6h细胞开始贴壁,48h后细胞完全贴壁生长,出现呈椭圆形、多角形的内皮细胞,以及呈梭形的成纤维样细胞,有的形成漩涡状生长集落;原代培养1周后细胞以梭形为主;传代后24h细胞基本完成贴壁,48h细胞开始分裂增殖,5～7d可见多核的成纤维样细胞贴壁,呈长杆状、三角形、梭形等。与对照组比较,实验组细胞生长状态较好,增殖较快,单位时间内获得的细胞数量明显增加(t=2.235,P<0.05),CD166阳性细胞率显著升高(t=1.638,P<0.01)。结论:血管内皮细胞生长因子可促进人脐静脉间充质干细胞贴壁,且更有利于间充质干细胞的增殖和纯化。
- 单伟秦书俭曾瑞霞张海锋李德华郑德宇
- 关键词：原代培养血管内皮细胞生长因子CD166
- 体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞最佳胚龄的筛选:孕2.5d与3.5d及4.5d比较被引量：2
- 2010年
- 背景:昆明小鼠基因型与人类近似,建立昆明小鼠胚胎干细胞系有利于其转基因动物的获得,但目前对于何时收集胚胎尚无明确报道。目的:探讨体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的最佳胚龄。方法:分别从孕2.5d,3.5d和4.5d的昆明系母鼠子宫中分离收集胚胎,于显微镜下观察胚胎的形态、贴壁情况、内细胞团形成情况、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率等,并进行碱性磷酸酶染色。结果与结论:孕2.5d采集的胚胎多为16细胞期胚胎,孕3.5d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5d采集的胚胎多为囊胚。孕2.5d胚胎和孕3.5d胚胎的贴壁率、内细胞团形成率、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率均无明显差异(P>0.05);孕4.5d胚胎上述指标均显著高于前两者,更适合作为胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代的材料。
- 张海锋单伟秦书俭
- 关键词：昆明小鼠胚龄内细胞团胚胎胚胎干细胞
- 接种密度对人脐静脉间充质干细胞原代培养的影响被引量：2
- 2007年
- 目的：探讨不同接种密度对人脐静脉间充质干细胞（hUV-MSCs）原代培养的影响,从而确定原代培养hUV-MSCs的适宜条件。方法：分离人脐静脉内皮及内皮下层细胞,按不同接种密度分组进行原代培养,记录原代培养时间,然后进行传代和成骨诱导培养,并检测细胞钙结节的表达情况。结果：hUV-MSCs原代分离培养消化30min,种植细胞密度为5×10^5×10^6/cm^2的方法较合理。经化学药物（如地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C）成骨诱导后,可形成钙结节。结论：合理hUV-MSCs原代培养方法,可以快速获得最大量的自体种子细胞,从而为组织工程化骨的体外构建创造条件。
- 单伟张海锋马云胜郑德宇谷学静秦书俭
- 关键词：原代培养骨组织工程
