目的:建立大肠埃希氏菌(Escherichia coli,E.coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)多重荧光定量PCR检测方法,用于桶装水中E.coli和P.aeruginosa的同时检测。方法:根据国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中uid A和gyr B基因序列设计引物和探针,优化体系退火温度,构建多重荧光定量PCR检测体系,评价方法特异性、灵敏度、重复性和回收率,同时将该方法用于检测桶装水中的E.coli和P.aeruginosa。结果:多重荧光定量PCR能够同时检测E.coli和P.aeruginosa,方法检测周期短,从核酸提取到完成PCR扩增只需要2.0 h。方法检测灵敏度高,E.coli和P.aeruginosa的检测限均为102CFU·mL^(-1),且扩增效率高、线性范围宽、标准曲线具有良好的线性相关性;组内重复性好,16组扩增数据的变异系数在0.58%~2.34%,均小于5%;方法特异性强,能够准确区分检测各种非目标菌,且引物和探针之间不存在交叉扩增;对高浓度目标菌回收率均在70%以上,且能够用于桶装水目标菌的加标检测。结论:该方法检测性能优越,能够同时、快速、灵敏、准确的检测桶装水中的E.coli和P.aeruginosa。
建立一种不对称聚合酶链式反应结合滚环扩增信号放大(Rolling circle amplification,RCA)的技术,对牛肉中单增李斯特菌进行快速灵敏检测。通过改变上下游引物的浓度,扩增得到一条带有通用序列的单链DNA,进而引发RCA反应,产生大量的G-四链体序列,硫黄素T嵌入G-四链体序列中产生荧光信号,从而实现对单增李斯特菌的检测。在最优的条件下,本研究所建立的方法对单增李斯特菌在PBS中的检测限为3.6×101 CFU/mL;在加标的牛肉中,其检测限达到了3.6×102 CFU/g。本研究所建立的方法可实现单增李斯特菌的快速检测,通过改变特异性的引物,该方法也可用于其他食源性致病菌的检测,具有较高的推广应用价值。
