王希辉
- 作品数：6 被引量：11H指数：2
- 供职机构：山东农业大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：山东省科技攻关计划国家现代农业产业技术体系建设项目国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生更多>>
- 鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测被引量：1
- 2010年
- 【目的】通过目的基因克隆,表达获得高产量具有生物活性的鸡白介素18成熟蛋白（maturechickeninterleukin-18,mChIL-18）。【方法】根据毕赤酵母密码子偏嗜性,通过引物设计来定点突变鸡白介素18基因,构建了重组质粒pPIC9K-mChIL-18。将线性化的重组阳性质粒电转到毕赤酵母GS115中,经筛选多拷贝阳性子后进行诱导表达。用MTT法和微量细胞病变抑制法检测其生物活性。【结果】筛选的多拷贝重组菌在诱导温度为28℃,培养液pH值为6.5,甲醇的诱导浓度为2%,诱导时间为120h时表达量最高,约为480mg/L。表达的mChIL-18蛋白能够刺激SPF鸡淋巴细胞大量增殖,用400μg/L的mChIL-18诱导淋巴细胞产生γ-干扰素（IFN-γ）,其生物活性最高可达1.7×104U/mL,且能有效抑制水泡性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的生长。【结论】毕赤酵母能够高效表达具有生物活性的鸡白介素18,有望作为免疫佐剂运用到工业化生产和兽医临床中。
- 王希辉岳寿松胡敬东黄亦钧陈金龙王婷婷范忠玲赵宏坤
- 关键词：毕赤酵母突变体生物活性
- 山羊IL-18成熟蛋白在昆虫细胞／杆状病毒中的表达及其活性分析被引量：1
- 2011年
- 目的:在昆虫细胞/杆状病毒中表达山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白,并对其生物学活性进行分析。方法:将编码山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白的基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual上,构建重组质粒pFastBac Dual-gIL18,将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18,在Cellfectin作用下,将Bacmid-gIL18转染昆虫细胞sf9,收获感染后不同时间段的细胞,进行SDS-PAGE、Western blot检测和生物学活性分析。结果:重组蛋白获得正确表达具有良好的免疫原性;生物学活性分析表明,重组蛋白能够促进淋巴细胞增殖、诱导淋巴细胞分泌IFN-γ。结论:用昆虫细胞/杆状病毒系统成功表达了gIL-18成熟蛋白,且具有良好的免疫原性和生物学活性,从而为进一步研究gIL-18作为免疫调节剂和免疫佐剂在生产上的应用奠定了基础。
- 王婷婷王希辉范忠玲陈金龙曹丙蕾孔娜胡敬东赵宏坤
- 关键词：杆状病毒昆虫细胞生物学活性
- O型FMDV VP1基因与山羊IL-18基因在昆虫细胞中的共表达与活性检测
- 2011年
- 以杆状病毒pFastBacTM Dual为载体,将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因和山羊白介素18(gIL-18)基因,分别插入到双表达载体的P10启动子和多角体蛋白启动子PH的下游,构建重组质粒pFastBacTMDual-gIL18-VP1,然后转化DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18-VP1,并利用昆虫细胞进行转染。间接免疫荧光试验(IFA)检测表明gIL-18基因和VP1基因同时在同一细胞中独立表达。将共表达产物进行生物学活性分析表明,重组蛋白能够诱导山羊脾淋巴细胞生成IFN-γ抑制水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上生长。本试验用Bac-to-Bac系统成功构建了同时含有gIL-18基因和VP1基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达,且具有良好的生物学活性,从而为下一步研究gIL-18在口蹄疫(FMD)中的免疫调节作用奠定了坚实的基础。
- 王婷婷范忠玲王希辉陈金龙曹丙蕾孔娜胡敬东赵宏坤
- 关键词：VP1基因共表达SF9细胞
- 多重RT-PCR检测PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遗传变异分析被引量：4
- 2011年
- 根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法。2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多重RT-PCR技术同时检测PRRSV和CSFV的感染状况。检测结果显示,病料中高致病性PRRSV占57.1%（121/212）,CSFV占29.2%（62/212）。应用RT-PCR方法扩增山东不同地区16株PRRSV的ORF5基因,并进行了序列分析。结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性为97.0%~100.0%;与参考变异毒株JXA1、传统毒株VR2332核苷酸同源性分别为98.0%~99.5%和86.4%~87.7%。推导的氨基酸序列分析表明,16株毒株GP5蛋白氨基酸不存在缺失,但存在位点突变。12株在非中和表位29位点与准种进化34位点发生了突变,分别由V→A和N→S;1株在非中和表位185位点发生突变,由A→V;这与2007年流行的PRRSV毒株JXA1、HUN等不同。
- 张金强吴家强孟斌郭文龙王希辉李坤于江刘少宁张玉玉王金宝
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因
- 禽肠炎沙门菌外膜蛋白OMPX基因的克隆及其在乳酸乳球菌中的表达被引量：5
- 2011年
- 以禽肠炎沙门菌基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增得到外膜蛋白OMPX基因片段,并将其克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36e中,构建重组质粒pMG36e-OMPX。将重组质粒电转入乳酸乳球菌MG1614,得到重组基因工程乳酸乳球菌,在GM17培养基中培养12h后,经SDS-PAGE分析显示表达的蛋白约为16 000,与预期相符,经Western-blot检测表明,表达的蛋白具有良好的反应特异性。
- 陈金龙王希辉王婷婷胡敬东赵宏坤许瑞利
- 关键词：沙门菌外膜蛋白乳酸乳球菌
- 鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测
- 鸡白介素18(Chicken interleukin-18,ChIL-18)是新发现的一种细胞因子,它具有广泛的生物活性,除能够促进γ-干扰素(IFN-γ)的产生,刺激淋巴细胞转化,增强NK细胞的杀伤活性,还在介导细胞免...
- 王希辉
- 关键词：毕赤酵母突变体生物活性
