郭坤
- 作品数：58 被引量：131H指数：7
- 供职机构：复旦大学附属中山医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学化学工程文化科学更多>>
- 凝集素芯片检测肿瘤标志物糖蛋白N-聚糖及其在诊断中的意义被引量：5
- 2008年
- 背景与目的:肿瘤的发生、发展伴随着相关糖蛋白的糖基化改变,糖蛋白聚糖结构的多样性对其生理功能起着重要的作用。凝集素芯片是一种简单、快速、高通量的方法,可以分析肿瘤标志物糖蛋白的N-聚糖部分,是肿瘤相关糖蛋白质组学有力的研究工具。本研究探讨使用凝集素芯片检测肿瘤标志物糖蛋白N-聚糖,以期鉴别疾病性质。方法:利用生物芯片技术使用凝胶基片构建以不同凝集素和荧光标记糖蛋白特异性亲和为原理的凝集素芯片,可以检测糖蛋白的N-聚糖的特征性结构,比较相似糖蛋白的差异,进一步可以检测和比较不同来源相同肿瘤标志物糖蛋白的N-聚糖部分的细微差异。结果:凝集素芯片结果准确,荧光标记糖蛋白浓度与荧光值达10～1000nmol/L的Cy3浓度范围内存在线性关系,1mg/ml是合适的凝集素点样浓度;凝集素芯片非常敏感,在本研究的条件下,最低可测得达1pg的相应糖蛋白,凝集素芯片结合荧光探针技术可以鉴别不同来源甲胎蛋白N-聚糖结构的细微差别。结论:凝集素芯片检测糖蛋白N-聚糖结构切实可行、准确方便;凝集素芯片可以给出肿瘤标志物糖蛋白N-聚糖结构的信号模式图及其变化,在疾病的早期诊断方面具有重要意义。
- 陈培康晓楠孙璐郭坤樊嘉周俭邱双健汤钊猷刘银坤
- 关键词：凝集素生物芯片糖蛋白甲胎蛋白
- 非转移性和转移性人肝癌血清糖蛋白凝集素亲和谱的比较研究被引量：2
- 2011年
- 目的应用凝集素亲和技术寻找肝癌转移相关特征性血清糖蛋白凝集素亲和谱,并探讨其生物学意义。方法本研究利用含有13种肿瘤相关的凝集素集合芯片技术,比较研究了非转移性和转移性人肝癌血清糖蛋白凝集素亲和谱,同时采用多重凝集素印迹方法验证凝集素芯片结果。计量资料数据采用双样本异方差t检验,进行两两比较。结果研究证明,与非转移人肝癌血清相比,转移性肝癌血清糖蛋白对麦胚凝集素(wheatgerm agglutinin,WGA)、黑接骨木凝集素(sambucus nigra lection,SNA)、红腰豆凝集素(phaseolus vulgariserythroagglutinin,PHAE)和欧曼陀罗凝集素(datura stramonium lectin,DSA)的亲和作用增强(P<0.05)。提示转移性肝癌血清糖蛋白出现了增多的唾液酸(sialic acid,sia)、N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine,GlcNAc)、平分型GlcNAc及多天线、偏二天线糖链结构。结论血清糖蛋白聚糖链的变化与肿瘤侵袭和转移密切相关,为临床筛选肝癌侵袭及转移相关的糖标记提供了重要参考。
- 陈巧佩孙淳张舒康晓楠李岩郭坤孙璐秦雪刘银坤
- 关键词：肝癌肿瘤转移聚糖
- 热休克蛋白27促进人肝细胞肝癌侵袭转移的分子机制研究
- 第一部分 转移潜能不同肝癌细胞系中HSP27的表达及转移相关信号转导通路的基因组学分析
本部分的研究是应用细胞免疫荧光检测技术结合反转录PCR(RT-PCR)，实时荧光定量PCR，蛋白印迹(western bl...
- 郭坤
- 关键词：肝细胞肝癌热休克蛋白MAPK通路
- 人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质的鉴定及生物信息学分析被引量：2
- 2008年
- 糖蛋白质组学方法鉴定人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白质,将有助于发现肝癌、慢性肝病相关异常核心岩藻糖基化蛋白质.应用凝集素亲和层析技术、双向电泳(2-DE)联合基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS/MS)分析,建立人健康肝组织核心岩藻糖基化蛋白表达谱,图谱均点数为(130±3)个,挖取90个蛋白质点进行质谱鉴定,数据库搜索及去冗余后,共鉴定53种蛋白质,主要分布于pI5～9,分子质量为10～100ku区域处.Gene Ontology分类发现它们参与体内代谢等过程,应用NetNGlyc对它们进行糖基化位点预测,并通过蛋白质免疫沉淀联合凝集素亲和印迹对其中的结合珠蛋白前体,α烯醇化酶的核心岩藻糖基化进行了再验证.以上结果提示,凝集素层析、2-DE联合MALDI-TOF-MS/MS分析是一种鉴定某种特定类型糖蛋白的高通量检测方法,所建立的表达谱可用于发现疾病发生、发展中相关的异常核心岩藻糖基化蛋白质.
- 代智樊嘉周俭柏斗胜邱双健康晓楠崔杰峰郭坤李岩刘银坤
- 基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒
- 本发明公开了一种基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒，该试剂盒包括ELISA酶标板、磁珠‑AAL、Hp‑ELISA酶标板，其利用了肝癌患者的单位Hp岩藻糖含量增多，Hp与AAL的亲和力提高这一原理，建立了磁珠‑...
- 张舒郭坤刘银坤
- 文献传递
- 一种三维转移性肝癌类组织体外模型的构建方法
- 本发明提供了一种三维转移性肝癌类组织体外模型的构建方法，其特征在于，具体步骤为：将高转移人肝癌细胞系MHCC97H在RWV生物反应器与生物支架PLGA(聚乙醇酸－乳酸共聚物)结合的三维旋转培养体系中连续培养15天形成转移...
- 崔杰峰刘银坤唐建华陈荣新徐长德康晓楠郭坤
- 文献传递
- CK8寡糖链结构及翻译水平改变与人肝癌细胞转移相关性研究被引量：7
- 2007年
- 糖组学方法筛查人肝癌细胞转移过程中发挥重要作用的核心岩藻糖基化蛋白质分子,解析比较筛出的差异蛋白——细胞角蛋白8(CK8)翻译及糖基化修饰改变与人肝癌细胞转移潜能的关系.应用双向电泳(2-DE)、凝集素亲和印迹、凝集素亲和沉淀联合质谱分析技术,筛查并验证与肝癌转移相关的核心岩藻糖基化蛋白;应用细胞免疫荧光和蛋白质免疫印迹检测CK8的蛋白质表达情况;应用免疫沉淀结合多种凝集素亲和印迹,推测其与肝癌转移相关的寡糖链结构改变.研究发现,3种不同转移潜能人肝癌细胞Hep3B、MHCC97-L和MHCC97-H的扁豆凝集素(LCA)亲和印迹表达谱中,分子质量55～60ku、等电点4～6区域处有核心岩藻糖基化蛋白呈差异表达,质谱鉴定为CK8.LCA亲和沉淀及蛋白质印迹进一步验证CK8异常核心岩藻糖基化与肝癌转移相关;研究发现,CK8分布于细胞浆内,在MHCC97-L和MHCC97-H细胞中蛋白质表达水平较Hep3B高,在MHCC97-H中与LCA和蓖麻凝集素(RCA-1)的亲和力较Hep3B强.以上结果提示,2-DE和凝集素印迹技术联合MALDI-TOF-MS/MS分析可用于筛查疾病过程相关的异常糖基化蛋白质分子,CK8蛋白水平、核心岩藻糖基化及β-1,4末端半乳糖基化的增加均与肝癌细胞转移潜能相关.
- 代智刘银坤郭坤孙强玲卢雯静杨芃原
- 关键词：肝癌细胞肿瘤转移CK8
- 醛酮还原酶1B10基因沉默对MHCC97H细胞生长和基因表达的影响被引量：6
- 2010年
- 目的 探讨醛酮还原酶1B10（AKR1B10）基因在肝癌发生和发展过程中的作用及其机制.方法 化学合成AKR1B10序列特异性小干扰RNA,用脂质体LipofectaminrTM2000介导转染人肝癌细胞系MHCC97H,设实验组转染AKR1B10-小干扰RNA,设阴性对照组转染非编码序列双链小RNA,设空白对照组不作转染.用实时定量PCR、Western blot和酶活性检测法检测AKR1B10 mRNA和蛋白的表达情况,用细胞计数试剂盒CCK-8检测转染细胞的生长增殖变化,用流式细胞仪检测膜联蛋白V/碘化丙啶双标记的凋亡细胞变化,并用实时定量PCR检测c myc、c-fos、N-ras、ki-67、caspas 3、bax肿瘤相关基因的表达变化.用析因设计的方差分析和完全随机方差分析进行组间比较,LSD法进行多重比较.结果 转染24、48 h和72 h后,AKR1B10 mRNA的相对表达量在实验组分别为0.382±0.048、0.098±0.008和0.257±0.032;阴性对照组分别为0.797±0.092、0.742±0.086和0.794＋0.105;空白对照组分别为0.808±0.118、0.716±0.083和0.706±0.067.不同转染时间和不同实验组中AKR1B10 mRNA的表达比较,F值分别为11.650和566.971,P值均＜0.01,差异均有统计学意义.转染24、48 h和72 h后,实验组的AKR1B10mRNA表达较空白对照组被明显抑制,抑制率分别为52.7%±5.6%、86.3%±4.4%和63.7%±6.1%,以转染48 h的抑制率最高（t=80.68,P＜0.01）;阴性对照组的表达水平接近空白对照组（P＞0.05）.Western blot结果显示,转染24、48 h和72 h后,实验组的AKR1B10蛋白表达水平均有下降,其中以转染72 h的降低幅度最大;阴性对照组的表达水平接近空白对照组.转染24、48、72h和96h后,实验组450nm处吸光度值分别为1.465±0.040、1.724±0.106、1.934±0.069和2.377±0.163;阴性对照组分别为1.528±0.044、2.019±0.091、2.711±0.204、3.151±0.159;空白对照组分别为1.567＋0.057、2.102±0.099、2.642±0.198、3.069±0.180;不同转染时间和不同实验组间比较,F值分别为128.092、36.535,P值均＜0.0
- 韦薇梁宏洁崔杰锋郭坤康晓楠曹骥苏建家李瑗刘银坤
- 关键词：肝细胞基因转染RNA干扰
- 热休克蛋白27在转移潜能不同人肝癌细胞系中的表达及机制研究被引量：12
- 2007年
- 利用不同转移潜能肝癌细胞系探讨热休克蛋白27(HSP27)参与肝癌细胞转移潜能形成的可能分子机制.细胞免疫荧光技术、RT-PCR和免疫印迹技术显示,HSP27在转移潜能不同的肝癌细胞Hep3B、MHCC97L和MHCC97H中定位于细胞浆,亦可见于细胞核,HSP27 mRNA和蛋白质的表达水平与肝癌细胞转移潜能呈正相关.高转移潜能肝癌细胞系MHCC97H的HSP27 RNA干扰试验结果显示,HSP27 RNA干扰后MHCC97H的侵袭(MHCC97H组:21.36±2.92;对照RNAi组:19.88±2.23;RNAi组:11.40±2.05)、运动能力(MHCC97H组:26.35±3.29;对照RNAi组:24.43±3.17;RNAi组:10.92±2.27)明显减弱,细胞凋亡显著增加(MHCC97H组:15.12%;对照RNAi组:17.56%;RNAi组:27.64%).同时进行信号转导基因芯片检测发现,HSP27干扰后核因子κB(NF-κB)通路抑制,并且免疫印迹显示细胞核内活化的NF-κBp65减少,细胞内磷酸化IκBα降低.另外,免疫共沉淀检测发现,在肝癌细胞内HSP27可与IKKβ、IκBα共沉淀,且在HSP27RNA干扰后IKKβ与IKKα结合能力下降.这些结果提示,HSP27可能通过参与细胞内NF-κB通路的激活,影响细胞凋亡和细胞运动,在肝癌细胞侵袭转移过程中发挥作用.
- 郭坤刘银坤周海君代智陈洁孙瑞霞孙强玲卢雯静康晓楠
- 关键词：热休克蛋白27信号转导RNA干扰
- stathmin蛋白促进人SMMC-7721肝癌细胞增殖侵袭能力被引量：2
- 2014年
- 目的构建微管解离蛋白stathmin过表达的人SMMC-7721肝癌细胞株,并探讨stathmin过表达对肝癌细胞增殖侵袭的影响。方法采用脂质体将Flag-pcDNA3.1-stathmin重组质粒和Flag-pcDNA3.1空质粒分别转染人SMMC-7221肝癌细胞,抗生素加压筛选,构建稳定表达stathmin的SMMC-7721细胞(实验组),以稳转空质粒的细胞为对照组,Western blot对建系细胞进行鉴定。采用CCK-8和软琼脂克隆形成实验检测细胞增殖;流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡和细胞周期;体外细胞运动侵袭实验(Transwell)测定细胞的运动、侵袭能力。结果实验组中stathmin的表达0.76±0.12较对照组0.16±0.05明显增加(P<0.05),成功构建了过表达stathmin的人SMMC-7721肝癌细胞株;CCK-8和软琼脂克隆形成实验显示,实验组的细胞增殖较对照组明显增加(A4500.60±0.05 vs.0.29±0.03,P<0.01);实验组细胞凋亡降低[(5.80±0.33)%vs.(11.57±1.09)%,P<0.05],细胞周期阻滞在G2/M期;Transwell实验结果证实,与对照组比较,实验组细胞运动和侵袭能力均显著加强[运动实验透膜细胞数:(54.03±7.21)个vs.(130.45±14.13)个;侵袭实验透膜细胞数:(17.75±2.52)个vs.(57.76±8.50)个],差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 stathmin的过表达能促进人SMMC-7721肝癌细胞的增殖侵袭能力。
- 龚舒陶忠桦刘晓燕郭坤刘银坤甘淋
- 关键词：STATHMIN细胞增殖肿瘤浸润肿瘤转移
