陈翀
- 作品数：155 被引量：149H指数：6
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- Blimp-1在小鼠异基因造血干细胞移植后对GVHD的影响
- 陈翀宋旭光张焕新曹江潘彬安立才刘凯歌徐开林
- 关键词：BLIMP-1异基因造血干细胞移植GVHD
- GST-NRP-1融合蛋白的原核表达及纯化被引量：1
- 2015年
- 目的:构建带有GST标签的人NRP-1融合蛋白原核表达载体,在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达,并进行包涵体的复性及纯化。方法:利用RT-PCR扩增人NRP-1基因,将其克隆至p CR-blunt载体,酶切制备NRP-1基因片段,插入表达载体p GEX-4T-1,生成p GEX-4T-1-NRP-1,转入BL21感受态细胞以IPTG诱导其蛋白的表达。裂解细菌后行Western blot检测GST-NRP-1融合蛋白的表达,表达的包涵体经复性后用Glutathione Sepharose 4B纯化。结果:RT-PCR扩增出NRP-1基因并连入p CR-blunt载体;经亚克隆构建了融合蛋白表达载体p GEX-4T-1-NRP-1。转入BL21感受态细胞后考马斯亮蓝染色检测到GST-NRP-1融合蛋白的表达,经包涵体复性后得到纯化的融合蛋白。结论:成功构建带有GST标签的人NRP-1融合蛋白原核表达载体,为进一步研究NRP-1的结构、功能及其与之相互作用的蛋白奠定了基础。
- 韩正祥张梦瑾徐杰王红梅杜秀平陈翀徐开林
- 关键词：NRP-1原核表达融合蛋白纯化
- 基因工程Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后GVHD和GVL效应的影响被引量：2
- 2010年
- 目的 探讨输注慢病毒载体介导的小鼠基因工程调节性T淋巴细胞（Treg细胞）对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病（GVHD）及移植物抗白血病（GVL）效应的影响.方法 利用慢病毒载体介导,将小鼠叉状头螺旋转录因子（Foxp3）基因转导入Balb/c小鼠的CD4＋CD25-T淋巴细胞,即为基因工程Treg细胞.以Balb/c小鼠为供者.C57BL/6小鼠为受者,进行异基因骨髓移植,移植当天受者接受X线直线加速器全身照射.用随机数字表法将受者分为5组,每组10只.（1）单纯照射组：经受者尾静脉输注RPMI 1640培养液0.2 ml;（2）白血病对照组：经受者尾静脉输注供者骨髓细胞5×106个＋C57BL/6小鼠T淋巴细胞白血病/淋巴瘤细胞株（EL4细胞）500个;（3）移植对照组：经受者尾静脉输注供者骨髓细胞5×106个＋脾细胞5×106个＋EL4细胞500个;（4）工程Treg组：经受者尾静脉输注供者骨髓细胞5×106个＋脾细胞5×106个＋EL4细胞500个＋基因工程Treg细胞5×106个;（5）空载体对照组：经受者尾静脉输注供者骨髓细胞5×106个＋脾细胞5×106个＋EL4细胞500个＋空载体转导的CD4＋CD25-T淋巴细胞5×106个.每天观察受者存活情况;记录GVHD及白血病的发生情况;各组均于小鼠濒死前取其肝脏、小肠、皮肤、脾脏等组织,进行病理学观察;取长期存活（超过60 d）受者的骨髓细胞,检测嵌合情况.结果 单纯照射组、白血病对照组、移植对照组、工程Treg组和空载体对照组小鼠存活时间分别为（10.3±1.5）d、（20.7±1.9）d、（26.0±4.3）d、（49.0±17.7）d和（24.4±4.1）d,工程Treg组小鼠存活时间明显长于其他各组,差异有统计学意义（P＜0.05）.白血病对照组小鼠肝、脾组织病理切片均存在白血病细胞浸润表现,移植对照组及空载体对照组小鼠肝脏、皮肤和小肠病理切片存在GVHD病理改变,而工程Treg组长期存活小鼠各组织病理切片结构基本正常,
- 曹江李莉陈翀曾令宇李振宇程海徐开林
- 关键词：移植物抗宿主病移植物抗白血病
- 小鼠造血干细胞移植后移植物抗宿主病与内皮细胞损伤的关系
- 2010年
- 目的 探讨异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病（GVHD）与内皮细胞损伤的关系.方法 以C57BL/6小鼠为供者、Balb/c小鼠为受者,分4组进行异基因造血干细胞移植,每组受者15只：对照组（仅输入磷酸盐缓冲液）、单纯骨髓移植组（仅输入骨髓单个核细胞）、GVHD组（输入骨髓单个核细胞和脾细胞）、GVHD减轻组（在GVHD组基础上加用环孢素A）.分别于移植后不同时间观察受者的表现,检测外周血中内皮细胞及组织病理学变化.结果 术后第5天,各组受者均无典型的GVHD表现及组织病理学改变;术后第9天,GVHD组受者出现明显的GVHD的表现及病理学改变,并于15 d内全部死亡.术后第5天,单纯移植组、GVHD组和GVHD减轻组受者的外周血中内皮细胞数分别为（11.51±7.40）、（7.34±1.26）和（7.36±0.16）个/μl,三组间差异均无统计学意义（P＞0.05）;术后第9天,内皮细胞数分别为（10.49±5.61）、（153.64±35.35）及（47.82±4.69）个/μl,三组间差异均有统计学意义（P＜0.05）.术后第5天,单纯移植组、GVHD组、GVHD减轻组受者GVHD靶器官组织病理学评分分别为3.33±0.58、4.33±1.53及4.0±1.73,三组间差异均无统计学意义（P＞0.05）;术后第9天,评分分别为3.33±1.15、10.0及4.33±0.58,三组间差异均有统计学意义（P＜0.05）;术后第14天,评分分别为2.33±1.25、10.33±2.58和3.33±1.15,三组间差异均有统计学意义（P＜0.05）.结论 GVHD的发生再次引起内皮的损伤,同时损伤的内皮加重了GVHD.
- 闫志凌贾路许世娟徐开林潘彬宋国梁陈翀曾令宇
- 关键词：造血干细胞移植内皮细胞内皮损伤移植物抗宿主病
- Prdm1基因敲除小鼠的繁育和基因型鉴定被引量：1
- 2012年
- 本研究目的是繁育和鉴定prdm1基因敲除的小鼠,为进一步研究Blimp-1蛋白的功能奠定基础。将所引进的2种转基因纯合子小鼠B6.prdm1flox/flox和B6.Lck-Cre进行饲养并繁殖,繁殖成功后获得第1代小鼠,将第1代小鼠再次进行交配获得基因型为:B6.prdm1wild/wild.Lck-Cre、B6.prdm1wild/wild、B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre、B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6.prdm1flox/wild。提取第2代小鼠基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增Cre和loxp基因片段后琼脂糖凝胶电泳分别检测cre和loxp基因组DNA的大小。取基因型为B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre即为条件性基因prdm1敲除小鼠,选择B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6小鼠作为对照,应用磁珠分选脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞,并应用Western blot方法检测Blimp-1目的蛋白。结果表明,2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,其子代相互繁殖后第2代小鼠分离比例基本符合孟德尔遗传规律,亦可以成功获得较多的prdm1基因敲除小鼠。结论:应用Cre-loxp系统可以成功地获得prdm1基因敲除的小鼠。
- 陆小云陈翀潘秀英曾令宇李振宇宋旭光徐开林
- 关键词：BLIMP-1PRDM1基因敲除
- 慢病毒介导可溶性肿瘤坏死因子受体1在小鼠骨髓未成熟树突状细胞中的表达(英文)被引量：8
- 2010年
- 背景:肿瘤坏死因子α是介导树突状细胞成熟的重要细胞因子之一,可溶性肿瘤坏死因子受体1与其结合可阻断肿瘤坏死因子α的作用,维持树突状细胞于不成熟状态,诱导免疫耐受。目的:构建含有人sTNFR1的慢病毒表达载体,观察其在未成熟树突状细胞中的表达。方法:以人外周血单个核细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增出sTNFR1基因片段,亚克隆至慢病毒转移质粒pXZ208,通过IRES连接eGFP报告基因,建立双顺反子慢病毒转移质粒,命名为pXZ9-sTNFR1,DNA测序鉴定。采用脂质体转染293FT细胞,根据报告基因eGFP测定病毒滴度。采用小剂量粒-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4体外培养扩增C57BL/6小鼠骨髓来源树突状细胞。培养第5天,以pXZ9-sTNFR1重组慢病毒上清感染未成熟树突状细胞,RT-PCR检测感染后sTNFR1转录,Western blot法检测sTNFR1蛋白表达,观察sTNFR1基因修饰及脂多糖刺激后树突状细胞的表型特征。结果与结论:成功构建重组质粒pXZ9-sTNFR1,转染293FT细胞24h后观察到eGFP表达,病毒滴度在106U/L以上。RT-PCR显示pXZ9-sTNFR1感染的未成熟树突状细胞sTNFR1呈阳性表达,Western blot检测到sTNFR1蛋白存在于感染后未成熟树突状细胞和培养上清中。培养第5天的树突状细胞低表达CD40、CD86、CD80和MHCⅡ类分子,脂多糖刺激后,高表达MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86分子,显示出成熟型树突状细胞表型特征,sTNFR修饰的树突状细胞MHCⅡ类分子和CD40、CD80、CD86分子表达水平无变化。提示:①成功构建了负载sTNFR1基因片段及含eGFP报告基因的慢病毒载体,获得了高滴度的重组慢病毒颗粒。②经慢病毒高效转导的未成熟树突状细胞sTNFR1 mRNA及蛋白稳定地表达,可以保护未成熟树突状细胞不被外源性脂多糖刺激活化,维持树突状细胞于非成熟状态。
- 黄一虹晁亚丽汤仁仙王淑华曾令宇陈翀潘秀英徐开林
- 关键词：可溶性肿瘤坏死因子受体基因修饰慢病毒载体未成熟树突状细胞
- 基于小鼠模型的异基因骨髓移植中合适移植细胞量的实验研究
- 2010年
- 目的探讨在小鼠异基因骨髓移植模型中的合适移植细胞量。方法 6～8周雌性BALB/c小鼠经7.0GyX线全身照射后,4h内分别输入1×106(A组)、5×106(B组)、1×107(C组)、2×107(D组)个6～8周雄性C57BL/6J小鼠的骨髓细胞,比较移植后各组小鼠存活率、外周血白细胞、T和B淋巴细胞数量及移植组的嵌合情况。结果 C组生存率明显低于其它各组(P<0.05);A、D组嵌合率达95%以上后出现回落;D组造血及免疫重建较其它组提前达正常水平。结论一定范围移植细胞量越多越有利于移植后造血及免疫重建;生存率、植入率及节约干细胞资源方面综合评估,5×106可作为移植优势剂量。
- 许世娟贾路徐开林丁爽陈翀曾令宇
- 关键词：异基因骨髓移植
- 慢病毒介导的B区缺失的人凝血因子Ⅷ在NOD/SCID小鼠中的持续表达(英文)被引量：3
- 2012年
- 近年来,基因治疗作为一种新的治疗方法给血友病A的治疗提供了新的思路。本研究旨在探讨在体外和NOD/SCID小鼠中应用慢病毒载体介导的血友病A基因疗法的可能性。构建含有B区缺失的人凝血因子Ⅷ(BDDhFⅧ)基因和IRES-eGFP编码序列的慢病毒表达载体pXZ9/BDDFⅧ。通过3质粒共转染293FT包装细胞,包装后感染293FT,HLF,Chang-liver和人骨髓间充质干细胞。在感染后分别通过酶联免疫吸附试验(ELISA),一期法,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和聚合酶链反应(PCR)法检测凝血因子Ⅷ(FⅧ)活性,FⅧ抗原,FⅧ的mRNA转录和基因整合情况。超速离心收集病毒颗粒,并通过门静脉注射感染NOD/SCID小鼠。ELISA分析小鼠血浆FⅧ抗原,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,转导后1个月RT-PCR分析小鼠肝脏人FⅧ的转录情况。结果表明:成功制备高浓度的重组慢病毒,并能在体外高效转导靶细胞。感染后72 h能检测到高水平的FⅧ活性和FⅧ抗原。RT-PCR和PCR法能敏感检测到人FⅧ基因转录和整合至感染后的细胞中。在所有接受重组慢病毒颗粒注射后的NOD/SCID小鼠肝脏中均能检测到人FⅧ基因的转录,同时重组慢病毒也能在体内高效转导小鼠肝细胞。在感染后72 h小鼠血浆中人FⅧ水平为(49±6)mU,1周后为(54±8)mU,1个月后为(23±4)mU。结论:携带BDDhFⅧ基因的慢病毒颗粒在体内外能高效转导靶细胞,且所有被转导的靶细胞都能有效的分泌人FⅧ。经过门静脉注射慢病毒颗粒的NOD/SCID小鼠可以持续表达人FⅧ。
- 李艳杰陈翀曾令宇曹江徐开林
- 关键词：慢病毒载体NOD/SCID小鼠血友病A基因治疗
- Blimp-1在小鼠骨髓移植后GVHD中的作用
- 宋旭光陈翀吕超王曼徐开林
- 红色荧光蛋白标记的小鼠白血病模型的建立
- 2010年
- 目的 利用红色荧光蛋白（DsRed）标记的小鼠淋巴瘤EL4细胞株,建立荧光标记的小鼠白血病模型,并对模型进行分析和鉴定.方法 将EL4/DsRed细胞以低剂量（5×10^2/只）、中剂量（5×10^3/只）、高剂量（2.5×10^4/只）经尾静脉注入经清髓照射的C57BL/6小鼠体内,同时接种骨髓细胞5×10^6/只,采用流式细胞术（FCM）、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、组织病理等方法鉴定小鼠成模情况.结果 C57BL/6小鼠接种不同剂量EL4/DsRed细胞后白血病发病率达100%,移植后第2周FCM示受鼠肝、脾、骨髓和外周血中有大量EL4/DsRed细胞;各组组织器官病理检查呈现出不同程度的肿瘤细胞浸润.结论 用DsRed标记的EL4细胞以5×10^2/只植入C57BL/6小鼠,即可成功建立荧光标记的小鼠白血病模型,可为白血病发病机制、微小残留病检测等研究提供有价值的动物模型.
- 陈翀李艳杰曹江王东洋曾令宇潘秀英徐开林
- 关键词：荧光抗体技术
