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基因序列分析鉴定犬冠状病毒分离株被引量：4: 2003年; 采用双脱氧末端终止法测定了克隆于重组质粒YS1pUC、CI1pUC上的2株国分离病毒CCV YS1、CI1部分纤突蛋白基因序列,以计算机软件推导氨基酸序列,进行核苷酸和氨基酸序列的多重比校,绘制系统进化树,分析重要抗原位点氨基酸残基的变化情况,预测蛋白质疏水性和二级结构。结果表明:重组质粒中含有571bp的外源基因,核苷酸和氨基酸序列与国外发表的K378等5株CCV相应序列的同源性分别为91.7％～99.4％和92.0％～99.4％,而与猪传染性胃肠炎病毒PUR46株和猫传染性腹膜炎病毒1146株的同源性为90.2％和88.0％～90.0％。A抗原的Ab亚位点上的氨基酸残基与各株CCV相同,不同于其他冠状病毒。由此进一步证明,2株国内分离病毒CCV YS1、CI1为犬冠状病毒。; 胡桂学柏亚铎高风山赵立峰夏咸柱; 关键词：基因序列分析犬冠状病毒分离株

禽类DNA疫苗研究进展被引量：6: 2005年; 新型疫苗的研究对于禽类传染病的防制意义重大。传统疫苗是基于抗原刺激机体产生特异性抗体的原理,它们大多数激发机体的体液免疫,很难启动细胞免疫。脱氧核糖核酸(DNA)疫苗作为第3代疫苗,具备传统疫苗和其它基因工程苗不可比拟的优点,能够诱导全方位的免疫反应且使用更安全更方便,DNA疫苗是将外源基因与真核质粒重组后直接导入细胞内,使外源基因在宿主细胞内表达合成保护性抗原蛋白。这是模拟病毒自然感染提呈过程,既能产生细胞免疫,又能产生体液免疫。文章对DNA疫苗在禽类应用的可行性和应用研究新进展作了综述。; 李新生闫若潜陈红英高风山李云岗夏春; 关键词：禽类

重叠延伸PCR法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ被引量：2: 2006年; 本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ)重链(α链)胞外区与轻链(β2m)成熟肽的重组嵌合分子。采用RT-PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列;采用重叠延伸PCR(Splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR)把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT-PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因,大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物,以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段;测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连,阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。; 李新生闫若潜高风山方勤美郝惠芳李云岗陈红英夏春; 关键词：重链重叠延伸PCR

鸡复等位基因BF2与β2m的结构解析: 2006年; 为了阐明鸡主要组织相容性复合体I(BF)和β2微球蛋白(β2m)不同复等位基因的分子结构,利用pMAL-p2X／E．coli TB1系统表达了5类不同复等位基因BF2的胞外区和一类新的β2m,并采用纯化、蛋白酶切和Western blot进行了鉴定．最后,采用圆二色谱(CD)测定了各重组蛋白的二级结构以及同源模建了其三级结构．5类不同复等位基因的BF2蛋白分子中的α-螺旋、β-片层、转角和随机卷曲的氨基酸长度分别为69—73,67—72,35—37和94—98．5类不同复等位基因BF2和一类新的β2m蛋白分子的同源模建揭示了其结构与人和鼠的MHC I类分子类似,但各有其特征性的结构;研究获得了正确折叠、不同复等位基因的BF2和β2m蛋白分子,并为进一步形成BF2-β2m复合体、鉴定抗原表位提供了依据．; 李新生闫若潜高风山方勤美李云岗郝惠芳夏春; 关键词：Β2M 圆二色谱同源模建

珍珠鸡MHC Ⅰ轻链基因的克隆、可溶性表达与纯化被引量：1: 2006年; 为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。; 李新生闫若潜方勤美郝惠芳崔沛高风山李云岗徐守振夏春; 关键词：珍珠鸡轻链可溶性表达

5类等位基因鸡BF2胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化: 2007年; 从鸡脾脏中提取总RNA，以总RNA为模板，5＇-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-（T）15—3’为反转录引物，采用TaKaRa AMV反转录酶合成First—strand cDNA（fcDNA）。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列，设计了含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的2对引物，分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后，插入到含LaeZ基因的原核克隆载体pGEM—T Easy中，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定，筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector，构建重组质粒p2X／BF2（1—5）。将重组表达质粒转化人大肠杆菌TB1感受态细胞，筛选阳性克隆，经IPTG诱导表达后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。结果表明，本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列，试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子，全长约807～819bp，编码约269～273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化，并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC工类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。; 李新生杜向党陈红英高风山李云岗夏春; 关键词：胞外区可溶性表达纯化

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高风山

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