刘霜
- 作品数：3 被引量：6H指数：2
- 供职机构：成都军区昆明总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 靶向preC/C基因特异性RNAi对乙型肝炎病毒在肝癌细胞系中
- 目的探讨靶向HBVpreC/C基因的siRNA在人Huh-7和HepG2.2.15细胞中抗病毒疗效。方法根据GenBank登录号U95551基因组序列,设计并合成靶向HBV preC/C基因的3个21nt的siRNA,随...
- 边中启刘霜刘明秋肖安焦晔严维耀郑兆鑫
- 靶向preC／C基因特异性RNA干扰对乙型肝炎病毒在肝癌细胞系中复制与表达的影响被引量：3
- 2012年
- 目的探讨靶向乙型肝炎病毒（HBV）preC／C基因的小干扰RNA（siRNA）在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2．2．15细胞中抗病毒基因治疗效果。方法根据GenBank中HBV（GenBank登录号U95551）基因组序列，设计合成靶向HBVpreC／C基因的3个长2l核苷酸（nt）的siRNA，设计1个对照的非同源长2Int的siRNA，分别克隆到pU6质粒中，构建3个shRNA表达载体pU6-C1，pU6-C2，pU6-C3和对照pU6-C4；为了检测siRNA功能建立报告基因系统，以pT-HBVl．3为模板，PCR合成目的基因preC／C，克隆到绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体（pEGFP-N1）中构建携带EGFP报告基因的重组质粒pEGFP．preC／C（E-C）。将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞，或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2．2．15细胞。首先，在Huh-7细胞中使用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测EGFP融合表达细胞计数，评估该shRNA在转染后不同时间对EGFP融合报告基因表达的抑制效应；接着在HepG2．2．15细胞中，运用ELISA检测转染后24、48、72和96h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量；免疫荧光技术检测转染后72h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平；实时荧光定量PCR（real-timePCR）进一步检测HBVmRNA转录产物cDNA的拷贝变化。结果发现siRNA表达质粒与E．C共转染Huh-7细胞后48h，与pEGFP-N1单质粒转染相比，pU6-C1，pU6-C2或pU6-C3共转染组使EGFP表达水平降低了80％，而对照pU6-CA或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达，差异有统计学意义（P〈0．01）；免疫荧光技术检测发现HepG2．2．15细胞内HBsAg和HBcAg表达显著降低，real-timePCR发现pU6．C1、pU6-C2或pU6．C3共转染HepG2．2．15细胞后48h，使mRNA转录产物的cDNA含量分别降低了73．9％±1，2％（P=0．029）、48．2％±1．8％和35．8％±1．4％（P：0．037，0．040），而不论pU6-CA或pU6对照共转染组均不能降低cDNA含量，差异均有统计学意义（均P〈0．01）；pU
- 边中启刘霜刘明秋肖安焦晔严维耀郑兆鑫刘雪松
- 关键词：肝炎病毒乙型RNA干扰基因疗法
- 靶向C基因的shRNA抗乙型肝炎病毒在BHK-21细胞中的复制与表达被引量：3
- 2010年
- 目的 研究靶向乙型肝炎病毒（HBV）C基因的shRNA（shRNA）诱导RNAi（RNAi）在BHK-21细胞中抑制HBV的复制与表达及抗病毒效果.方法 根据成都军区昆明总医院传染病中心克隆测序的中国56个民族CHB患者HBV基因组（基因型B属ayw1亚型）已在GenBank登录注册：CYN/2002和CYN/2000（GenBank登录号AY517488,AY517489,等）,为了监测siRNA功能提供报告基因系统,将HBV C基因PCR产物克隆构建成报告基因表达载体pC-EGFP-N1和载体pCDNA3.1B（-）,设计并构建两个靶向同源（CYN/2002和CYN/2000）毒株HBV C基因的长24核苷酸（nt）的shRNA表达质粒（S1和S2）,随机设计的用于对照的非同源长24 nt的shRNA表达质粒S3,将其克隆到载体pU6上,构建成表达目的 shRNA重组表达载体,并与pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞.首先在BHK-21细胞中使用BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测绿色荧光蛋白（EGFP）表达细胞数量,评估该shRNA表达质粒在转染后不同时间对C基因/EGFP融合报告基因表达的抑制作用,接着在BHK-21细胞中通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）进一步检验了shRNA抗病毒效果.结果 通过BH-2型荧光显微镜观察和FACS-440型流式细胞仪检测,发现在shRNA表达质粒和pC-EGFP-N1共转染BHK-21细胞24 h后,与pC-EGFP-N1或pEGFP-N1单质粒转染相比,S1或S2的共转染组、S1＋S2的共转染组使EGFP的表达水平降低了90%,而对照质粒S3或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达水平,差异有统计学意义（P＜0.01） 应用RT-PCR检测C基因mRNA和EGFP基因mRNA的表达量,结果与BH-2型荧光显微镜和FACS-440型流式细胞仪检测结果相吻合,差异有统计学意义（P＜0.01）.进一步证实了RNAi抗病毒效果,抗病毒效应持续时间超过48 h.结果 发现,创建的靶向C基因的shRNA能够有效特异地抗C-EGFP基因在BHK-21细胞中的复制与表达.结论 靶向C基因的RNAi技术能够有效特异地抗HBV在BHK-21细胞中的复制与表达.RNA
- 边中启孙璐璐陈维灶肖安马世武崔志磊刘霜刘明秋严维耀郑兆鑫
- 关键词：短发夹状RNA微RNA
