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利用CRISPR/Cas系统快速高效构建血友病乙小鼠模型被引量：9: 2015年; 血友病乙是由凝血因子Ⅸ(FactorⅨ,FⅨ)缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病,为伴X染色体隐性遗传病。小鼠模型对于血友病乙的研究具有十分重要的意义,而基因组编辑技术又为小鼠模型的构建提供了一种快捷而且高效的途径。本文利用CRISPR/Cas系统,在小鼠FⅨ基因第8外显子上选择靶位点,将Cas9 m RNA和带有靶位点的sg RNA显微注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,获得基因修饰的小鼠。利用高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting,HRM)技术进行精确基因分型,并通过测序验证,在60只小鼠中,总共有51只小鼠的靶位点发生了突变,突变率高达85%,其中雄鼠的突变率为79.5%,雌鼠的突变率为95.2%;未检测到非目标位置的基因编辑脱靶。凝血活性实验显示,突变小鼠的FⅨ活性值(FactorⅨcoagulant activity,FⅨ:C)是非突变小鼠的6.82%,大大低于非突变小鼠,表明突变小鼠的凝血活性缺失。本研究表明,利用CRISPR/Cas系统成功构建了人类血友病乙遗传病小鼠模型。; 汪启翰怀聪孙瑞林庄华陈红岩费俭卢大儒; 关键词：血友病乙小鼠模型

SpCas9结构域相互作用关键氨基酸的动态网络分析被引量：1: 2016年; CRISPR-Cas9系统是一种操作简单、灵活性好、识别和切割效率高的基因编辑技术,具有用于基因治疗的潜能。然而,由于该系统的主要组分Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)蛋白过大,难于向靶细胞运输,因而亟需构建截短体蛋白,以提高系统的运输效率、扩展其应用前景。前期结构研究表明,SpCas9结构域分界清晰,各结构域功能相对独立又彼此协同,易于通过对各结构域进行分步改造实现蛋白截短优化。但报道的晶体结构缺乏SpCas9的全长结构,及结构域间相互作用的关键信息。针对此问题,本文运用分子动力学(Molecular Dynamics, MD)模拟和动态网络分析方法研究SpCas9-sgRNA-DNA复合物结构。我们首先对已有晶体结构的缺失片段进行补齐,构建了一个包含全长SpCas9及DNA链的三元复合物原子结构。然后对复合物结构进行长时间尺度MD模拟,通过动态网络分析方法分析了SpCas9蛋白各结构域间的相互作用,找出影响SpCas9结构域间相互作用的关键氨基酸。与已有实验结果比较,所识别的位点是SpCas9蛋白正常工作的关键氨基酸。因此,本研究不仅可以加深人们对SpCas9作用机制的了解,也为SpCas9蛋白的优化改造提供理论指导。; 李干王国栋怀聪黄强; 关键词：分子动力学模拟

耐热DNA连接酶介导的TLCR技术在简化DNA重组实验中的应用被引量：2: 2016年; 传统的DNA重组方法 TypeⅡ型限制酶技术受到片段纯化的限制,无法做到复杂混合体系中DNA片段的特异性连接。为解决这个问题,本研究将耐热连接酶链式反应(Thermostable ligase chain reaction,TLCR)引入DNA片段的连接与捕获。该技术利用耐热型DNA连接酶的特性,在热循环反应中配合针对目的片段末端序列设计的单链寡核苷酸连接模板——Helper,实现目的片段的特异性连接和产物数量的指数性增长。两个质粒构建实验被用于验证TLCR技术的可行性和应用效果。首先利用TLCR技术从一个未经纯化的含有7种不同大小片段的混杂体系中特异性地将一段1.5 kb的片段捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验准确率达到80%,验证TLCR技术在复杂混合体系中特异性连接DNA片段的可行性和准确性。在另一个质粒构建实验中,TLCR技术从λ噬菌体基因组Hind消化物中将两段总长达27 kb的片段按顺序捕获进载体,随机抽取的克隆样品经检验同样达到了80%的准确率。结果表明,TLCR技术能够简化DNA重组实验的操作,并且适用于多片段和大片段的连接,可以为生物学研究提供便利。; 周翔达宋晓怀聪孙海燕陈红岩卢大儒; 关键词：HELPER

以人类血型为遗传学案例教学的思考与实践被引量：18: 2013年; 血型是人类日常生活中非常常见的一种遗传表型,拥有丰富的遗传学内涵。随着科技的发展,其内涵不断得到新的揭示,新的研究结果不断补充,持续吸引着人们对血型遗传机制的探索。血型遗传案例除了与孟德尔遗传和连锁遗传、基因突变和染色体畸变四大内容关联外,还涉及到其他多方面的遗传学知识点。在教学中,依据遗传学的知识脉络,贯穿以ABO血型作为经典案例,结合拓展的白细胞血型,孟买、Rh、MN等血型的遗传规律及其应用,并且开展相关的实验教学,理论联系实际,增强了学生的兴趣,提高了教学效果。在遗传学实验教学中,有80%的学生选择ABO血型鉴定这个自选实验,并表示出对这个实验的浓厚兴趣。在讲授相关知识点时,用恰当的血型案例为引导,设计相关的讨论主题,开展PPT展示性讨论和辩论式讨论,所有的学生都积极主动参与进来,与现实生活相结合,引导学生思考问题,使学生的思维在辨析中得到操练,提高分析问题和解决问题的能力,深刻理解遗传学基本理论知识。; 皮妍李晓莹怀聪王诗铭乔守怡卢大儒; 关键词：遗传学案例教学

利用CRISPR系统高效快速构建血友病B小鼠模型: 血友病B为凝血因子Ⅸ(FactorⅨ,FⅨ)基因突变或缺失导致的FⅨ蛋白功能异常或缺失引发的凝血功能障碍.传统上,血友病小鼠的模型构建采用同源重组的方法,该方法虽能大片段地造成基因缺失,抑制FⅨ活性,但其耗时长,筛选纯合...; 汪启翰怀聪孙瑞林周宇庄华陈红岩费俭卢大儒

利用CRISPR/Cas系统对血友病B小鼠进行基因纠正的初步探索: 2015年; 血友病B是人类常见的X染色体遗传的隐性遗传疾病,目前对于遗传疾病的治疗还没有很好的办法,通过基因治疗可以实现对遗传病的彻底治愈。本研究利用高效基因编辑技术CRISPR/Cas系统,对血友病B小鼠尝试基因修复进行初步的探索,将突变的凝血因子IX(Factor IX,FIX)基因进行同源替换,修复为正常序列。本研究中将同一种纯合突变类型的小鼠交配之后得到的受精卵,进行细胞核显微注射。对收集到的8枚囊胚的基因组中的靶位点,进行巢氏PCR扩增,直接进行测序检测基因型序列。检测结果为4枚囊胚的基因被成功编辑,其中3枚囊胚为靶序列的基因敲除突变,而有1枚囊胚成功进行同源重组,实现基因纠正。; 汪启翰孙瑞林怀聪卢大儒; 关键词：血友病B CRISPR 基因治疗基因修复

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怀聪