- 登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列具有干扰病毒复制的作用被引量：3
- 2013年
- 目的构建含有登革Ⅱ型病毒(DENV-2)前膜蛋白(prM)基因反向重复序列(irRNA)的重组质粒,评价其抑制病毒复制的效果。方法 DENV-2接种乳鼠,提取总RNA,在正义和反义引物两端分别加上XhoⅠ和EcoRⅠ的识别位点,将经RT-PCR扩增的prM全长基因片段插入pcDNA3.1(+)中,形成含有prM反向序列的重组质粒pcDNA-asprM;于另一对正义和反义引物两端引入酶切位点NheⅠ和BglⅡ,经RT-PCR扩增prM全长基因片段插入pMD18-T-vector中,形成含有正向序列的重组质粒pMD18-T-prM。限制性内切酶NheⅠ和KpnⅠ分别酶切重组质粒pMD18-T-prM和重组质粒pcDNA-asprM,得到片段prM和线性化载体pcDNA-asprM,连接构建成含有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。筛选的阳性重组质粒pcDNA-irRNA用脂质体法转染至BHK-21细胞中,半定量PCR和实时荧光定量PCR分析评估该质粒抑制登革病毒复制的效果。结果成功构建具有prM反向重复序列的重组质粒pcDNA-irRNA。经转染pcDNA-irRNA的实验组与未转染质粒阳性对照组相比,半定量PCR结果显示DENV-2攻击96 h后NS3的mRNA表达水平下降28%;实时定量PCR分析显示,DENV-2攻击72 h后实验组病毒拷贝数比阳性对照组少1.44倍,攻击96 h后实验组的NS1表达量明显低于阳性对照组(P<0.05)。结论 DENV-2 prM反向重复序列具有干扰病毒复制的效果,为登革病毒基因疫苗的研究提供理论依据。
- 朱娉婷潘京郑学礼
- 关键词：RNA干扰BHK-21细胞
- 白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞与登革病毒相互作用蛋白的筛选
- 2013年
- 目的筛选登革Ⅱ型病毒与白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞中的连接分子。方法富集纯化登革Ⅱ型病毒,用12%SDS-PAGE分析提取的C6/36细胞膜蛋白和白纹伊蚊中肠组织总蛋白,将分离胶上的蛋白转于硝酸纤维素膜(PVDF)上,应用病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)方法筛选白纹伊蚊中肠组织和C6/36细胞中表达连接登革Ⅱ型病毒的分子。结果白纹伊蚊中肠组织总蛋白经12%SDS-PAGE分离后转膜,分别与纯化的病毒液和阴性对照液孵育,用抗登革病毒单克隆抗体检测,结果显示病毒孵育组在分子量30kDa的位置有特异性的条带出现,而阴性对照组无此条带;用同样的方法筛选C6/36细胞上表达蛋白,病毒孵育组在分子量30kDa和40kDa的位置出现特异条带,而阴性对照组无。结论 VOPBA结果显示分子量为30kDa的分子在中肠组织与C6/36细胞中都能表达,具有连接登革Ⅱ型病毒的作用,对其氨基酸序列的鉴定和功能分析工作正在进行中。
- 潘京朱娉婷郑学礼
- 关键词：登革病毒受体分子
- 转染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重复序列的BHK-21细胞沉默病毒复制研究
- 登革病毒(dengue rivus, DENV)属于黄病毒科(Flavivirade)黄病毒属(Flavi virus),由其感染所引起的疾病包括：登革热(dengue fever, DF),登革出血热(dengue h...
- 朱娉婷
- 关键词：RNA干扰
- 文献传递
