杜军辉
- 作品数：18 被引量：65H指数：5
- 供职机构：西安交通大学医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金陕西省自然科学基金陕西省科学技术研究发展计划项目更多>>
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- 缺氧条件下自噬在视网膜血管内皮细胞血管生成中的作用被引量：8
- 2018年
- 目的研究缺氧条件下自噬对体外培养的小鼠视网膜血管内皮细胞（RVECs）增生、迁移和管腔形成的影响。方法取清洁级C57BL/6J小鼠50只，采用组织块培养法分离和培养小鼠RVECs，采用CD34免疫荧光染色法对培养细胞进行鉴定。将生长良好的RVECs分为正常对照组、缺氧对照组及缺氧＋3-甲基腺嘌呤（3-MA）组。正常对照组细胞常规培养，缺氧对照组细胞在氧体积分数1%的环境下培养24 h，缺氧＋3-MA组细胞先用5 mmol/L 3-MA预处理4 h，然后在上述缺氧环境下培养24 h。采用Western blot法检测自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）比值及细胞中Beclin-1的表达；透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬小体的超微结构；分别采用Click-iT EdU试剂盒、细胞划痕法和Matrigel胶法检测细胞增生率、细胞迁移情况及细胞管腔形成情况。
结果原代培养后5～7 d培养的细胞呈铺路石样排列生长，CD34表达阳性。透射电子显微镜下缺氧对照组细胞自噬小体明显多于正常对照组和缺氧＋3-MA组。正常对照组、缺氧对照组和缺氧＋3-MA组细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值分别为0.243±0.030、0.658±0.032和0.405±0.095，Beclin-1蛋白相对表达量分别为0.260±0.040、0.650±0.071和0.461±0.089；细胞增生率分别为（45.93±6.39）%、（22.74±2.35）%和（24.12±3.59）%；细胞划痕愈合率分别为（36.02±5.84）%、（57.26±11.98）%和（18.16±9.73）%；细胞管腔形成数分别为（29.20±6.10）、（41.40±4.04）和（22.00±2.92）个；总体比较差异均有统计学意义（F＝35.86、23.53、34.28、21.12、23.27，均P〈0.01）。与正常对照组相比，缺氧对照组细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相对表达均明显增加，细胞增生率明显下降，划痕愈合率和管腔形成数明显增加，缺氧＋3-MA组细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1蛋白相对表达量、划痕愈合率和细胞管腔�
- 李蓉杜军辉姚杨于照祥樊卓常伟平
- 关键词：自噬血管生成缺氧视网膜新生血管缺血性视网膜病变
- 辛伐他汀抑制缺氧条件下人视网膜色素上皮细胞HIF-1α和VEGF的表达水平被引量：1
- 2022年
- 目的:探讨缺氧条件下辛伐他汀(Sim)对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE-19)细胞的影响及其可能机制。方法:将体外培养的人RPE-19细胞随机分为三组:对照组、缺氧组(培养基中CoCl_(2)的最终浓度为125μmol/L)和Sim处理组(在含有125μmol/L CoCl_(2)的RPE-19细胞培养基中加入3μmol/L Sim)。24h后,观察RPE-19细胞的形态,用MTT法检测细胞增殖,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹法检测缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的分泌水平和蛋白表达,采用免疫印迹法检测自噬蛋白的表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:缺氧条件下RPE-19细胞的形态发生了明显变化。缺氧组RPE-19细胞中HIF-1α和VEGF的蛋白表达明显增加,Sim治疗后显著降低。Beclin1和LC3B蛋白在CoCl_(2)+Sim组中的表达水平有所下降,且表达水平显著低于对照组和CoCl_(2)组。缺氧条件下,Sim抑制了RPE-19细胞增殖,促进了细胞的凋亡。结论:Sim可抑制缺氧条件下RPE-19细胞HIF-1α和VEGF蛋白的表达,抑制细胞增殖,促进凋亡,Sim促进RPE-19细胞凋亡的机制可能与其抑制自噬有关。
- 李夏王旖武炳慧陈灏元杜军辉
- 关键词：视网膜色素上皮细胞缺氧辛伐他汀脉络膜新生血管
- 自噬抑制剂3-MA抑制高糖条件下猴脉络膜视网膜血管内皮细胞血管形成被引量：8
- 2015年
- 目的研究高浓度葡萄糖对体外培养的猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)自噬水平的影响,探讨自噬抑制剂3-MA对RF/6A细胞新生血管形成的影响。方法取体外培养的生长良好的RF/6A细胞用于实验,将细胞随机分为4组,分别是对照组、低糖组(5 mmol/L的D-葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L的D-葡萄糖)、高糖+3-MA组(5 m M的3-MA预处理细胞后加入含25 mmol/L的D-葡萄糖培养液培养)。24 h后通过MTT法检测细胞活力,细胞划痕法检测细胞迁移,基质胶(Matrigel)法检测血管管腔形成,观察高糖对RF/6A细胞活力、迁移、管腔形成的影响及其3-MA的作用。结果 1同对照组比较,低糖组RF/6A细胞活力下降,高糖组RF/6A细胞活力进一步下降(P<0.05),高糖+3-MA组细胞活力较低糖与高糖组明显提高(P<0.05);2对照组、低糖组、高糖组、高糖+3-MA组细胞迁移面积(像素)分别是:40250±2015,44528±2273,55793±2158,39726±1983,组间差异具有统计学意义(P<0.05);3对照组、低糖组、高糖组、高糖+3-MA组RF/6A细胞管腔形成数分别为16.9±3.3,19.8±3.6,24.7±1.9,10.9±3.3,组间差异有统计学意义(P<0.05);与对照组比较,D-葡萄糖促进RF/6A细胞管腔形成(P<0.05),而3-MA能够显著抑制RF/6A细胞管腔的形成。结论高糖能够抑制RF/6A细胞活力,促进RF/6A细胞迁移和管腔形成,通过3-MA预处理可以一定程度恢复细胞活力,显著抑制高糖诱导的细胞迁移和管腔形成。提示自噬可能参与调控高糖诱导的视网膜新生血管形成。
- 杜军辉刘佳丽马乐李蓉张中李俊琪成静
- 关键词：新生血管细胞自噬
- 自噬对视网膜色素上皮细胞表达bFGF及TGF-β2的调控作用被引量：2
- 2018年
- 目的观察缺氧条件下自噬对视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)及转化生长因子β2(transforming growth factor,TGF-β2)的调控作用。方法将体外培养生长良好的ARPE-19细胞随机分为4组:对照组(常氧条件下培养),缺氧组(在1%O_2/5%CO_2/94%N_2缺氧箱中培养24h),缺氧+3-MA组(加入10 mmol/L自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤,3-MA)及缺氧+CQ组(加入50μmol/L自噬抑制剂氯喹,CQ),后三组均在缺氧箱中培养24 h。采用Western blot法检测细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3 B,LC3B)、Beclin-1及p62的表达,ELISA法检测细胞上清液中b FGF及TGF-β2的浓度。结果正常对照组、缺氧组、缺氧+3-MA组和缺氧+CQ组细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值分别为0.24±0.02,0.50±0.05,0.34±0.01和0.67±0.05;Beclin-1相对表达量分别为0.32±0.040,0.97±0.05,0.78±0.06和0.54±0.01;p62相对表达量分别为1.03±0.02,0.32±0.10,0.78±0.08和0.96±0.02;b FGF的浓度(pg/ml)分别为1 771.01±110.38,3 709.79±262.68,3 026.24±230.39和2 610.01±183.52;TGF-β2的浓度(pg/ml)分别为256.11±27.63,516.85±57.94,439.45±17.53和353.58±33.12。与正常对照组相比,缺氧组细胞的LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值、Beclin-1的蛋白表达明显增加,p62明显下降(P<0.05),b FGF及TGF-β2水平升高(P<0.05)。与缺氧组相比,缺氧+3-MA组或缺氧+CQ组抑制自噬能明显减少或增加LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达,减少Beclin-1的表达,增加p62的表达,同时减少b FGF及TGF-β2的表达。结论缺氧导致RPE细胞自噬激活,进一步调控RPE细胞b FGF及TGF-β2的表达。
- 田瑾李蓉杜军辉姚杨
- 关键词：自噬视网膜色素上皮细胞BFGFTGF-Β2细胞缺氧
- TNF-α通过刺激RF/6A细胞表达SDF-1促进血管生成被引量：4
- 2016年
- 目的研究肿瘤坏死因子α(TNF-α)对体外培养的猴脉络膜/视网膜内皮细胞(RF/6A)表达基质细胞衍生因子-1(SDF-1)及细胞增殖、迁移和管腔形成的影响,探讨TNF-α参与视网膜血管形成的初步机制。方法取体外培养的生长良好的RF/6A细胞用于实验,将细胞随机分为对照组、不同浓度TNF-α组(1、10、100 ng/ml)、TNF-α+AMD3100组(SDF-1拮抗剂AMD3100预处理1 h,培养液中最终浓度为1μg/ml,然后加入TNF-α)。培养24 h、48 h后采用ELISA法检测细胞上清液中SDF-1含量,MTT法检测细胞增殖,细胞划痕法检测细胞迁移,基质胶(Matrigel)法检测管腔形成。结果 1TNF-α(1 ng/ml)作用24和48 h,RF/6A的SDF-1表达量与对照组无明显差异;TNF-α(10、100 ng/ml)作用后两个时间点SDF-1表达量均明显高于对照组(P<0.01);TNF-α(10 ng/ml)+AMD3100组SDF-1表达量较TNF-α(10 ng/ml)组明显减少(P<0.05)。2TNF-α不同浓度作用24 h的细胞相对增殖率均高于对照组(P<0.05),且随着TNF-α浓度的升高而增加;除1 ng/ml浓度组外,TNF-α各组作用48 h的相对增殖率均较对照组升高(P<0.05);TNF-α(10 ng/ml)+AMD3100组的细胞相对增殖率在24 h和48 h时均明显小于TNF-α(10 ng/ml)组(P<0.05)。3TNF-α(10 ng/ml)组RF/6A细胞24 h的迁移距离明显大于对照组(P<0.05),TNF-α(10ng/ml)+AMD3100组迁移距离较TNF-α(10 ng/ml)组减小(P<0.05);培养48 h后,各组之间的差异与24 h的结果类似(P<0.05)。4TNF-α(10 ng/ml)组管腔形成数明显多于对照组(P<0.01),TNF-α(10ng/ml)+AMD3100组明显少于TNF-α(10 ng/ml)组(P<0.01)。结论 TNF-α能够促进RF/6A细胞表达SDF-1,诱导细胞增殖、迁移和管腔形成,拮抗SDF-1的作用可明显抑制TNF-α诱导的血管生成。提示TNF-α促进RF/6A细胞的血管生成过程可能是通过刺激细胞产生SDF-1实现的。
- 李蓉杜军辉常远
- 关键词：血管生成视网膜新生血管肿瘤坏死因子Α基质细胞衍生因子-1
- 血管内皮细胞生长因子抑制剂对视网膜血管内皮细胞自噬的促进作用被引量：4
- 2018年
- 目的观察血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂对小鼠视网膜血管内皮细胞(retinal vascular endothelial cells,RVECs)自噬水平的影响。方法将RVECs随机分为五组:正常对照组、缺氧对照组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)组、VEGF抑制剂(anti-VEGF)组和3-MA+anti-VEGF组。采用Western blot法检测RVECs中两种自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)及Beclin-1的表达;计算绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)阳性斑点细胞占比;透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬体的超微结构。结果正常对照组、缺氧对照组、3-MA组、anti-VEGF及3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为0.182±0.125、0.587±0.101、0.309±0.151、0.914±0.037及0.585±0.098;Beclin-1分别为0.205±0.035、0.590±0.120、0.425±0.082、0.842±0.087及0.607±0.022;GFP阳性斑点细胞比例分别为17.107%±3.521%、90.278%±2.684%、82.591%±4.490%、94.798%±1.760%及89.472%±3.764%。与正常对照组相比,缺氧对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达增高,GFP阳性斑点细胞的比例增加(均为P<0.05),同时自噬体增多。与缺氧对照组相比,3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低(均为P<0.05),同时自噬体减少;anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率升高(均为P<0.05),同时自噬体增多。与anti-VEGF组相比,3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低(均为P<0.05),同时自噬体减少。结论VEGF抑制剂对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的自噬水平有促进作用。
- 李蓉杜军辉姚杨李晓艳
- 关键词：自噬血管内皮细胞生长因子视网膜血管内皮细胞
- 糖代谢异常者血浆同型半胱氨酸水平与周围神经病变的关系被引量：4
- 2018年
- 目的探讨糖代谢异常、初诊断2型糖尿病患者血浆同型半胱氨酸水平与糖尿病周围神经病变的关系。方法于我院门诊及住院患者中就诊的糖代谢异常(IGT)者38例(IGT组)及2型糖尿病(T2DM)患者42例(T2DM组),于我院健康体检中心随机抽取健康对照20名(C组)。分别对三组人群检测血浆同型半胱氨酸(Hcy)水平,并使用肌电图仪分别检测三组人群的感觉神经及运动神经传导速度。再将三组人群依据Hcy浓度分别于组内分为亚组1(Hcy<15μmol/L)和亚组2(Hcy≥15μmol/L)。结果 IGT组和T2DM组分别与C组比较,血浆Hcy水平均显著升高(P<0.05),感觉、运动神经传导速度显著下降(P<0.05)。三组人群内各亚组间进行比较,正常对照组亚组间,感觉、运动神经传导速度无显著性差异(P>0.05);IGT亚组间,感觉、运动神经传导速度无显著性差异(P>0.05);T2DM亚组间,亚组2感觉、运动神经传导速度均显著下降(P<0.05)。结论糖代谢异常时,高浓度同型半胱氨酸血症对神经系统损伤不显著,高浓度血糖伴随高浓度同型半胱氨酸血症加重了神经系统的损伤。
- 润琳王芳李小凤王翔杜军辉成淑英张利红农晰婷
- 关键词：2型糖尿病糖代谢异常同型半胱氨酸周围神经病变
- 高糖环境对视网膜血管内皮细胞自噬的影响及机制被引量：4
- 2019年
- 目的研究高糖培养环境对恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)自噬的影响及机制。方法将体外培养的RF/6A细胞随机分为对照组、高糖组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)+高糖组,对照组细胞在无糖培养基中培养,高糖组细胞在培养基中加入25mMD-glucose进行培养,3-MA+高糖组用5mg/ml3-MA预处理1.5h,然后置于含25mMD-glucose的培养基中继续培养。培养48h后,采用Westernblot法检测各组细胞的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)、Atg5及关键信号通路蛋白PI3K、AKT、mTOR的表达,采用可表达mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的腺病毒感染细胞,激光共聚焦显微镜下观察细胞内自噬的变化。结果①对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中的LC3B-II/LC3B-I值、Atg5值分别为(0.19±0.02、0.58±0.06和0.43±0.04)和(0.35±0.05、0.96±0.06和0.83±0.06),组间总体比较差异均有统计学意义(LC3B-II/LC3B-I:F=55.58,P=0.000;Atg5:F=100.35,P=0.000)。高糖组细胞中LC3B-II/LC3B-I值和Atg5值均明显高于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05),3-MA+高糖组的LC3B-II/LC3B-I值和Atg5值均高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。②对照组、高糖组、3-MA+高糖组细胞中的PI3K值、AKT值和mTOR值分别为(0.93±0.06、0.94±0.07和0.89±0.07)、(0.95±0.05、0.94±0.04和0.90±0.02)和(0.81±0.04、0.82±0.04和0.80±0.02),组间总体比较差异均无统计学意义(均P>0.05);三组磷酸化蛋白p-PI3K值、p-AKT值和p-mTOR值分别为(0.74±0.02、0.40±0.02和0.70±0.02)、(0.87±0.02、0.47±0.02和0.77±0.06)和(0.76±0.03、0.38±0.02和0.70±0.02),组间总体比较差异均有统计学意义(p-PI3K:F=249.92,P=0.000;p-AKT:F=100.94,P=0.000;p-mTOR:F=218.21,P=0.000)。高糖组细胞中p-PI3K、p-AKT和p-mTOR值均明显低于对照组和3-MA+高糖组,差异均有统计学意义(均P<0.05),3-MA+高糖组的p-PI3K、p-AKT和p-mTOR值均低于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。③对照组细胞浆中出�
- 姚国敏李蓉姚杨杜军辉王小娣邓颖
- 关键词：自噬高糖PI3K/AKT/MTOR
- 自噬抑制剂3-MA对缺氧诱导的人视网膜色素上皮细胞表达TNF-α的抑制作用
- 2018年
- 目的研究自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对缺氧条件下人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法将体外培养的ARPE-19细胞随机分为对照组、缺氧组和3-MA+缺氧组,对照组细胞在常氧条件下培养,缺氧组细胞在缺氧箱(1%O2/5%CO2/94%N2)中进行培养,3-MA+缺氧组先在培养基中加入10 m M 3-MA,然后置于缺氧箱中继续培养。采用Western blot法检测各组细胞的自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 B (LC3B)、Beclin-1及p62的表达;采用ELISA法检测各组细胞上清液中TNF-α的浓度。结果 (1)对照组、缺氧组、3-MA+缺氧组细胞的TNF-α浓度分别为(59. 46±5. 22) pg/ml、(135. 80±11. 30) pg/ml和(105. 88±10. 42) pg/ml,总体比较差异有统计学意义(F=50. 53,P=0. 000),缺氧组的TNF-α浓度明显高于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 01),3-MA+缺氧组的TNF-α浓度高于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01)。(2)对照组、缺氧组、3-MA+缺氧组细胞中的LC3B-II/LC3B-I值、Beclin-1值及p62值分别为(0. 20±0. 03、0. 58±0. 07和0. 40±0. 09)、(0. 32±0. 04、0. 97±0. 05和0. 78±0. 06)和(1. 03±0. 02、0. 32±0. 10和0. 78±0. 08),组间总体比较差异均有统计学意义(LC3B-II/LC3B-I:F=21. 73,P=0. 002; Beclin-1:F=149. 34,P=0. 000; p62:F=69. 53,P=0. 000)。缺氧组细胞中LC3B-II/LC3B-I值和Beclin-1值均明显高于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 05),3-MA+缺氧组的LC3B-II/LC3B-I值和Beclin-1值均高于对照组,差异均有统计学意义(均P <0. 05)。缺氧组细胞中p62值明显低于对照组和3-MA+缺氧组,差异均有统计学意义(均P <0. 01),3-MA+缺氧组的p62值低于对照组,差异有统计学意义(P <0. 01)。结论缺氧激活RPE细胞自噬并促进其TNF-α的表达,自噬抑制剂3-MA可在一定程度上抑制自噬进程,从而发挥抑制细胞表达TNF-α的作用。
- 李蓉郭丹萍杜军辉姚杨
- 关键词：视网膜色素上皮肿瘤坏死因子-Α缺氧
- 脂联素对高糖条件下RF/6A细胞的保护作用被引量：3
- 2019年
- 目的观察脂联素(adiponectin,APN)对高糖培养条件下恒河猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(monkey choroid-retinalendothelial cell line,RF/6A)增殖及凋亡的影响。方法将体外培养的生长良好的RF/6A细胞随机分为空白对照组(PBS)、甘露醇对照组(25 mmol/L甘露醇)、高糖组(25 mmol/L D-葡萄糖)、高糖+APN组(25 mmol/L D-葡萄糖+10μg/mlAPN),各组加入不同的药物处理48 h。分别采用CCK-8法检测细胞增殖,Western blot检测细胞凋亡关键蛋白Bax、Bcl-2的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果高糖组(71. 42%±2. 29%)和高糖+APN组(90. 87%±1. 68%)细胞增殖率低于空白对照组(100%±0%)和甘露醇对照组(99. 09%±0. 46%)(P <0. 001);与高糖组相比,高糖+APN组细胞增殖率明显升高(P <0. 001)。高糖组和高糖+APN组的RF/6A细胞Bax的相对表达量高于空白对照组和甘露醇对照组(P <0. 001)。高糖组和高糖+APN组细胞Bcl-2的相对表达量低于空白对照组和甘露醇对照组(P <0. 001)。与高糖组相比,高糖+APN组细胞Bax的表达明显降低,Bcl-2的表达明显升高(均P <0. 001)。高糖组及高糖+APN组细胞凋亡率均比空白对照组和甘露醇对照组增多(P <0. 001)。与高糖组相比,高糖+APN组细胞凋亡率明显减少(P <0. 001)。结论 APN处理可抑制高糖培养条件下的RF/6A细胞凋亡,促进细胞增殖,提示APN对视网膜血管内皮细胞具有一定的保护效应。
- 李蓉杜军辉姚国敏王小娣姚杨
- 关键词：脂联素高糖培养视网膜血管内皮细胞凋亡细胞增殖
