刘瑞平
- 作品数：6 被引量：31H指数：3
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- 人胰岛素样生长因子Ⅰ基因对兔关节软骨细胞的有效转染及表达被引量：3
- 2008年
- 目的研究人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因构建的真核表达载体质粒对兔关节软骨细胞的有效转染和表达。方法将hIGF-Ⅰ基因构建在pcDNA3.1质粒上,经FuGENE6介导转入兔关节软骨细胞;设未转hIGF-Ⅰ基因软骨细胞作对照。转染后第3天用RT-PCR技术检测hIGF-Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚合素在mRNA水平的表达,用细胞爬片免疫组织化学和Westernblot测定hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达。结果RT-PCR显示hIGF-Ⅰ在转染组中琼脂糖电泳318bp处见到相应的目的条带,而对照组未出现目的条带;Ⅱ型胶原和聚合素在转染和对照组中以β-actin为参照半定量检测分别增加到1.3倍和1.4倍(P<0.05)。免疫组织化学显示转染组细胞爬片有hIGF-Ⅰ表达的棕黄色颗粒,对照组胞浆中未见棕黄色颗粒,转染组胞浆中出现大量的Ⅱ型胶原棕黄色颗粒。Westernblot显示转染组细胞在7.6KDa标记处有hIGF-Ⅰ的蛋白条带出现对照组则没有。结论FuGENE6介导的重组hIGF-Ⅰ基因真核表达载体质粒可有效转染兔关节软骨细胞,在mRNA和蛋白水平上有效表达hIGF-Ⅰ及Ⅱ型胶原,表达的hIGF-Ⅰ能在mRNA水平上增加Ⅱ型胶原和聚合素的合成,保持软骨细胞表型的稳定。
- 刘瑞平范卫民高共鸣马益民
- 关键词：关节软骨细胞
- 腺病毒介导的hIGF-Ⅰ基因转染对构建组织工程软骨的影响被引量：6
- 2009年
- 目的探讨腺病毒介导的人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因转染对构建组织工程软骨的影响。方法分离新西兰大白兔关节软骨细胞,培养到第一代,用荧光标记的Ad/hrGFP-hIGF-Ⅰ转染,然后接种在PLGA支架上(转染组);未转染的软骨细胞接种在PLGA支架上(对照组),在体外培养2周。利用荧光显微镜、Western blot、RT-PCR、免疫组织化学等方法鉴定hIGF-Ⅰ基因的有效转染,并观察其对构建的组织工程软骨细胞外基质的影响。结果Ad/hrGFP-hIGF-Ⅰ能对兔关节软骨细胞进行有效转染,RT-PCR显示构建的组织工程软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原、聚合素的表达高于对照组;定量检测显示胶原和GAG的含量高于对照组(P<0.01)。结论腺病毒介导的hIGF-Ⅰ基因转染能成功转染兔关节软骨细胞,用它构建组织工程软骨能显著促进软骨细胞外基质的合成。
- 刘瑞平范卫民高共鸣马益民
- 关键词：腺病毒软骨细胞
- 携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建
- 2009年
- 目的探讨构建携带hIGF-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性。方法从pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ。鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ)。再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度。将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达。结果成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的条带,Western blot得到7.6kDa大小的目的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达。结论成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体。
- 高共鸣范卫民刘瑞平卫积书马益民
- 关键词：腺病毒载体转染
- 不同频率周期性压力对组织工程软骨的影响被引量：18
- 2007年
- 目的观察不同频率周期性压力对组织工程软骨的影响。方法将兔关节软骨细胞接种到PLGA支架上,随机分成4组。A、B、C组分别在频率为0.01、0.1、1 Hz的周期性压力(强度0～200 kPa)下培养;D组不加压,为对照组。2周后采用组织化学,免疫组织化学法观察四组工程软骨的细胞增殖及基质分泌。并定量检测硫酸糖氨多糖(GAG)含量。结果四组之间Ⅱ型胶原染色面积百分比及GAG含量差异均有统计学意义(分别F=478.379,P<0.01;F=67.402,P<0.01)。其中B组工程软骨细胞最多,排列规则,Ⅱ胶原染色面积百分比[(83.95±2.23)%]和GAG含量[(476.33±25.66)μg]最高(P<0.01)。结论周期性压力对软骨细胞的新陈代谢具有促进作用,其中0～200 kPa、0.1 Hz频率的周期性压力能最好的促进软骨细胞增殖,合成Ⅱ胶原、GAG等细胞外基质。
- 张广程范卫民马益民岳海涛刘瑞平
- 关键词：软骨细胞
- 利用周期性静水压在水力聚焦生物反应器中构建组织工程软骨被引量：2
- 2009年
- 目的探讨在水力聚焦生物反应器（HFB）中加载周期性静水压构建组织工程软骨。方法分离培养兔关节软骨细胞并接种到PLGA支架上，细胞支架复合物分为加载周期性静水压的实验组和不加压的对照组，加压组的条件为：频率0．1Hz，压力0～200kPa，每天加压8h，两组均在HFB生物反应器中培养2周，利用免疫组织化学、RT-PCR、生物化学等方法观察周期性静水压对HFB生物反应器中构建的组织工程软骨的影响。结果免疫组织化学显示加压组的Ⅱ型胶原和甲苯胺蓝的染色面积明显大于对照组（P〈0001）。RT-PCR显示加压组的Ⅱ型胶原、聚合素的表达高于对照组（P〈0．001），但Ⅰ型胶原的表达低于对照组（P〈0.05）。生物化学定量检测显示加压组的总胶原和糖胺多糖（GAG）的含量显著高于对照组（P〈0．001）。结论周期性静水压对HFB生物反应器中构建的组织工程软骨具有显著的促进促进作用，并且稳定了软骨细胞的表型。
- 刘瑞平范卫民高共鸣张广成岳海涛马益民
- 不同强度周期性压力对组织工程软骨的影响被引量：12
- 2007年
- 目的探讨不同强度的周期性压力对组织工程软骨的影响。方法将兔关节软骨细胞接种到聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）支架上，随机分成四组，其中三组分别在压力强度为0～50kPa、0～100kPa、0～200kPa，频率0．1Hz的周期性压力下培养，另一组不加压，为对照组。2周后采用组织形态学、免疫组织化学法观察不同强度的周期性压力对组织工程软骨的结构及Ⅱ型胶原合成的影响．并定量检测组织工程软骨中氨基葡聚糖（GAG）的含量。结果在频率0．1Hz的周期性压力作用下，200kPa组支架内软骨细胞最多，排列规则，Ⅱ型胶原和GAG含量最高（P〈0．01）；100kPa组次之（P〈0．01）；50kPa组最差（P〈0．01）。三组加压组均优于对照组，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论组织工程软骨细胞增殖和合成Ⅱ型胶原、GAG的能力受周期性压力强度的调控，其中频率0．1Hz、强度200kPa的周期性压力能更好地促进软骨细胞增殖，合成Ⅱ型胶原、GAG等细胞外基质。
- 岳海涛范卫民马益民张广程刘瑞平
- 关键词：软骨细胞
