李伟娟
- 作品数：21 被引量：88H指数：5
- 供职机构：河南农业大学牧医工程学院更多>>
- 发文基金：河南省科技攻关计划国家自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- tPA信号肽和猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原核表达载体的构建被引量：5
- 2009年
- 根据GenBank(序列号E00896)上公布的人组织型纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator,tPA)的序列,利用在线信号肽分析工具Signal P3.0 Server预测出人tPA的信号肽共有63bp,设计1对能互为模板直接进行扩增的特异性引物,通过重叠PCR的方法扩增出tPA信号肽。另设计1对连接引物,利用PCR方法将tPA信号肽与已删除自身信号肽的ORF5基因相连,成功构建了用tPA信号肽取代猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因原有信号肽的原核表达质粒,为下一步GP5蛋白分泌表达及猪繁殖与呼吸综合征疫苗开发、诊断试剂盒的研制与应用奠定基础。
- 邱璜夏平安卢高峰王中明刘明莉李伟娟党占国
- 关键词：PRRSVORF5基因原核表达载体
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达
- 根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771bp的片段,并将扩增的片段...
- 刘明莉夏平安李伟娟王中明邱璜卢高峰崔保安
- 关键词：PRRSV原核表达
- 文献传递
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达被引量：1
- 2009年
- 根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771 bp的片段,并将扩增的片段插入pTG19-T载体进行测序而获得含有ORF2的阳性克隆pTG19-T-GP2。将此基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1,经筛选获得了阳性重组质粒pGEX-GP2,进而在IPTG的诱导下成功表达,获得了大小约为45 kD的融合蛋白,纯化后经Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性。
- 刘明莉李伟娟王中明邱璜卢高峰夏平安李素平崔保安
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒Hn-1/06株GP2蛋白的原核表达
- 根据GenBank中PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF2基因序列,利用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,经RT-PCRAK河南分离株Hn-1/06株扩增得到了大小为771bp的片段,并将扩增的片...
- 刘明莉夏平安李伟娟王中明邱璜卢高峰崔保安
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒原核表达生物学活性免疫特性
- 文献传递
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株NSP2和ORF5的变异分析
- 利用RT-PCR方法对2006年到2009年期间，从河南省不同地区疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒的猪场中，成功分离出9株PRRSV河南病毒株。根据GenBank上已发表的PRRSVCH-1a和VR2332株设计扩增NSP2和...
- 卢晓艳李伟娟张志远刘肖萍段二珍夏平安崔保安
- 关键词：NSP2ORF5基因克隆
- 文献传递
- 猪繁殖和呼吸综合症病毒河南地方株ORF5/6基因的克隆及真核表达
- 2008年
- 应用RT-PCR方法分别扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)河南地方株的ORF5和0RF6基因。将扩增基因克隆入真核表达载体pcDNA3.0中,设计不同引物自行构建重组质粒PcDNA-ORF5、ORF6和pcDNA-ORF5/6。运用磷酸钙法将重组质粒分别瞬时转染293T细胞,经流式细胞和westbloting试验分析表明共表达重组质粒PcD-NA-ORF5/6表达蛋白能够与PRRSV的阳性血清发生特异性反应,而pcDNA-ORF5-ORF6在293T细胞很难检测到蛋白表达。该结果表明蛋白质生物活性和其蛋白质空间构象有一定关系,也为下一步进行构建PRRSV假型病毒来研究ORF5/6蛋白的结构与功能的关系奠定了基础。
- 党占国李志勇夏平安陈溥言崔保安李伟娟王中明
- 关键词：PRRSV克隆真核表达
- 猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒河南分离株的遗传变异分析
- 经间接免疫荧光试验和RT-PCR鉴定,用Marc-145细胞从河南省不同地区送检的疑似猪繁殖与呼吸障碍综合征的病料中分离到16株猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV).扩增分离株的ORF5基因并进行序列测定.比较分析和...
- 李伟娟夏平安卢高峰党占国尹彦涛王中明邱璜崔保安
- 关键词：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒ORF5基因基因克隆
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株感染对仔猪免疫机能影响的差异被引量：7
- 2009年
- 20日龄猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阴性健康仔猪滴鼻感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Hn-1/06强毒株和BJ-4弱毒株,于接种后0、5、11、18、30、405、0 d无菌采血,制备血清和分离白细胞,并在感染猪发病死亡或第50天后分别剖杀取各器官组织。经RT-PCR方法检测,强弱毒株在血清、白细胞和各组织器官内分布基本一致;经ELISA方法和免疫荧光抑制试验及IFA流式细胞术检测,强弱毒株感染均诱导机体产生抗N蛋白抗体,强毒株的抗N蛋白抗体产生早于弱毒株;强毒株感染未能诱导产生中和抗体,弱毒株感染后第30天诱导产生了较低水平的中和抗体,随后逐步升高;在整个感染过程中,强毒感染猪CD3+T淋巴细胞及CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群均下降,CD4+/CD8+比值远远小于对照组,弱毒感染猪CD3+T淋巴细胞及CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群先下降,40 d后逐渐恢复正常水平,CD4+/CD8+比值先下降,11 d后开始逐步上升,18 d后超过对照组,近50 d恢复到正常水平。结果说明,在强毒株感染过程中,细胞免疫被抑制,不能产生有效的体液免疫,导致病毒快速增殖复制;在弱毒株感染过程中,细胞免疫和体液免疫先被抑制,后免疫功能逐步恢复正常水平,使体内病毒进一步被清除。
- 夏平安李伟娟周海范卢高峰刘明莉邱璜王中明崔保安
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒株强毒株
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的遗传变异分析被引量：2
- 2010年
- 用间接免疫荧光试验和RT-PCR方法，从河南省不同地区送检的疑似猪繁殖与呼吸综合征的病料中分离到16株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），扩增分离株的ORF5基因并进行序列测定、比较分析和绘制进化树．结果表明，16株分离株之间的氨基酸序列同源性为88．1％～99，8％；与欧洲型LV株和美洲型VR-2332株的氨基酸序列同源性分别为54．0％～54．5％和88．1％～99．2％，证明分离的16株病毒均为美洲型．用DNAstar等软件对16株分离株推导的氨基酸序列作进一步比较分析，发现16株分离株ORF5基因编码的gp5蛋白的抗原区、潜在疏水区、跨膜区和N-糖基化位点分布均有差异，与其它美洲型毒株也存在一定程度的差异，说明在河南流行的PRRSV存在明显的遗传差异性．
- 范旭李伟娟刘玉松徐红运张凤华赵琳段志刚夏平安崔保安
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因克隆
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立被引量：20
- 2009年
- 根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株ATCC VR2332的N蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从PRRSV Hn-1/06株中克隆了大小为372bp的N蛋白基因(EU025136)。将N蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-N,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为33000的可溶性融合蛋白N-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的29%。将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达91%。用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性。利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA方法(N-ELISA),并将所建立的N-ELISA与国外进口的PRRS检测试剂盒IDEXX-ELISA对200份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为92.7%。结果表明,本试验建立的N-ELISA与IDEXX-ELISA具有同样高的特异性。
- 夏平安尹彦涛李素平党占国王建举王中明李伟娟崔保安
- 关键词：PRRSVN蛋白ELISA
