目的建立基于ssDNA适配子的慢性粒细胞性白血病K562细胞的检测方法。方法利用Cell-SELEX(Sys-tematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术获得针对K562细胞的高特异性ssDNA适配子,以双位点结合模式试验原理,结合生物素链霉亲和素磁珠技术,建立K562细胞的特异性检测方法,并验证其特异性及灵敏度。结果利用建立的方法分别检测K562细胞、HL-60细胞及空白对照细胞,K562组与HL-60组和空白对照组荧光强度值差异有统计学意义(P<0.01),HL-60组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05),表明该方法特异性强;该方法能检测出数量小于100个的K562细胞,检测阈值低,灵敏度高。结论已成功建立了基于ssDNA适配子的检测K562细胞的新方法,为慢性粒细胞性白血病的分子诊断提供了一种新方法,也为分离K562细胞表面物质提供了新的思路。
目的:构建人源肝癌天然库容量大、多样性好的核糖体展示单链抗体库,为开发治疗性人源抗体奠定良好的实验基础。方法:分别收集40例人新鲜外周血各2mL(包括健康成年人和肝癌患者),进行淋巴细胞分离和总RNA的提取,通过设计合适的优化引物用RT-PCR技术扩增人抗体重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH)、轻链可变区基因(variable region of light chain,VL)和作为间隔区的轻链恒定区基因(consis tregion of light chain,CK)。采用改进的重叠延伸PCR(SOEPCR)技术将VH和VL进行拼接,连接肽为Linker(Gly4Ser)3。之后引入构建核糖体展示单链抗体(scFv)库模板所需元件,包括一个T7启动子、一个核糖体结合位点(Kozak序列)和翻译起始密码,以及作为间隔区的CK基因。模板基因片段连接T-载体转化E.coliDH5a大肠杆菌,对所构建的单链抗体库进行菌落PCR鉴定和测序分析。结果:①构建了库容量为2.65×1013的人源肝癌单链抗体库;②经菌落PCR鉴定和测序分析阳性重组子的序列,我们发现该抗体库具有丰富的多样性。结论:采用改进的重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法,对构建库容量高、多样性好的人源性肝癌核糖体展示单链抗体库,提高了建库效率。成功构建的抗体库,为后续筛选抗体、抗体修饰等工作打下扎实的实验基础。
