王孝功
- 作品数：5 被引量：18H指数：3
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 碱性MAGE家族新成员restin在大肠杆菌中的表达和抗体制备被引量：4
- 2005年
- 目的:从维甲酸诱导的白血病细胞系HL60中,克隆编码219个氨基酸的新基因restin,构建原核表达载体、制备抗血清并进行初步应用。方法:采用PCR技术,以维甲酸诱导的白血病细胞的cDNA为模板,扩增出restin的编码区。将其克隆入大肠杆菌表达载体中。经过温度诱导获得restin表达蛋白。利用SDS-PAGE纯化的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备该蛋白的抗血清。以该抗体做间接免疫荧光,初步观察restin在COS-7细胞内的表达分布。结果:大肠杆菌中表达的restin蛋白的Mr为26000。将其初步纯化后免疫新西兰白兔制备的抗血清,用Westernblot检测其效价为1∶800。间接免疫荧光显示,restin蛋白主要分布在细胞核内。结论:成功地制备抗restin的抗体,为进一步研究restin蛋白在组织中的表达、细胞内亚定位以及信号转导通路提供了前提条件。
- 路凡杨辉王孝功蒲勤李毅赵文明赵忠良
- 关键词：抗血清间接免疫荧光
- 人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测被引量：3
- 2006年
- 目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。
- 傅海燕张剑路凡蒲勤王孝功卢兹凡徐俊卿赵忠良
- 关键词：纯化生物学活性
- 重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵及其免疫学活性
- 2007年
- 目的:实现重组人黑色素瘤抗原MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌的高密度发酵,并测定MAGE3/HSP70融合蛋白在体内的抗肿瘤免疫效应.方法:利用自控发酵罐发酵,采用溶氧反馈,分批补料的方法对MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌进行了高密度发酵,从菌体中纯化MAGE3/HSP70融合蛋白,并用所纯化的MAGE3/HSP70融合蛋白免疫小鼠,运用酶联免疫斑点法(ELISPOT)和细胞毒性杀伤实验(LDH)检测了融合蛋白激活机体细胞免疫反应的状况.结果:高密度发酵取得成功,发酵菌中MAGE3/HSP70融合蛋白的表达量与摇瓶中的相当,摸索出发酵水平纯化MAGE3/HSP70融合蛋白工艺,ELISPOT和LDH显示MAGE3/HSP70可以激活机体免疫反应,并产生针对MAGE3的CTL,特异性杀伤表达MAGE3的肿瘤细胞.结论:MAGE3/HSP70融合蛋白工程菌成功实现高密度发酵,MAGE3/HSP70融合蛋白可以有效激活机体免疫反应,产生针对特异性抗原MAGE3的CTL,免疫学活性良好,为新型抗肿瘤疫苗临床前研究奠定了良好基础.
- 胡沛臻路凡王孝功李侠司少艳黄杨马斌张秀敏隋延仿
- 关键词：黑色素瘤抗原发酵大肠杆菌
- 溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌被引量：9
- 2007年
- 目的建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS BiofloⅣ20L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化。结果保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2mmol/LIPTG诱导5h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺。
- 胡沛臻温江田路凡王孝功李侠司少艳葛伟黄杨张秀敏隋延仿
- 关键词：黑色素瘤抗原
- 人防御素-α克隆表达纯化及生物活性初步检测被引量：2
- 2005年
- 张剑傅海燕杨瑞静蒲勤王孝功路凡赵忠良
- 关键词：生物活性克隆表达纯化杀灭作用细菌感染
