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人类免疫缺陷病毒1型病毒复制负调控因子编码基因的克隆及在BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中的表达被引量：3: 2008年; 目的:分离克隆人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码的病毒复制负调控因子(Negative factor,Nef)基因,并将其导入BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中进行表达。方法:根据GenBank登记的Nef基因核苷酸序列设计PCR引物,在其5′端分别引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点;以含有Nef基因的pCINL质粒为模板,扩增Nef基因,经双酶切后克隆进真核表达载体pCI-neo中。为了便于蛋白检测,在下游引物5′端引入Flag序列,构建重组真核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后分别瞬时转染BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞,用RT-PCR、Western blot分别从核酸和蛋白水平检测Nef基因的表达情况。结果:成功构建了含Nef基因的重组真核表达质粒,核酸序列分析显示,克隆的Nef基因序列全长651bp,与GenBank中登记的Nef基因序列100%同源,引入的Flag序列完全正确;RT-PCR和Western blot都在Nef预期位置检测到特异性条带。结论:HIV-1Nef基因在BCBL-1细胞和NIH/3T3细胞中获得了正确表达。; 曹戌华立新冯宁翰李久明吕志刚秦娣卢春; 关键词：人类免疫缺陷病毒1型真核表达

IL-10、IL-4及其受体启动子在人类单纯疱疹病毒1型激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒复制过程中的启动活性分析: 2008年; 目的:分离和鉴定人类IL-10、IL-10受体(IL-10Rα)、IL-4及其受体IL-4Rα启动子序列,并分析IL-10、IL-4以及其受体的启动子在人类单纯疱疹病毒1型(HSV-1)激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)过程中的启动活性。方法:以人类基因组DNA为模板,PCR扩增IL-10、IL-10Rα、IL-4Rα启动子区序列,并分别克隆载入pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的上游。进一步将上述构建的重组质粒与本室保存的含IL-4启动子重组质粒分别转染HSV-1感染的BCBL-1细胞,并作Luciferase活性检测。结果:分离了IL-10、IL-10Rα和IL-4Rα的启动子区域序列,并成功克隆了含启动子序列重组报告质粒;HSV-1感染的BCBL-1细胞在进一步转染了IL-10、IL-10Rα、IL-4和IL-4Rα启动子重组报告质粒后,其Luciferase值与相应的对照比较显著升高(P<0.05)。结论:在BCBL-1细胞中,HSV-1可通过直接激活IL-10、IL-4以及相应受体的启动子来上调它们的表达;在HSV-1感染的BCBL-1细胞中,IL-10和IL-4可能对KSHV的裂解复制起到促进作用。; 吕志刚卢春秦娣曾怡程林陈秀英; 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒白细胞介素启动子活性

HIV-I编码病毒蛋白R基因在真核细胞中的表达及其表达蛋白对KSHV溶解性周期复制的影响被引量：5: 2008年; 目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码病毒蛋白R(Vpr)基因的重组真核表达质粒并初步探索Vpr基因编码蛋白对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)溶解性周期复制的影响。方法:构建pVpr-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pVpr-Flag重组质粒临时转染BCBL-1和NIH3T3细胞,采用RT-PCR、IFA和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Vpr基因的表达情况;提取临时转染pVpr-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测KSHV次要衣壳蛋白编码基因ORF26(仅在病毒裂解期表达)mRNA转录水平,初步探索HIV-1Vpr基因编码蛋白对KSHV复制的影响。结果:克隆的Vpr基因序列与GenBank中已登记的Vpr序列100%同源。RT-PCR、IFA和Western blot结果显示Vpr基因mRNA及其编码蛋白在真核细胞中得到了转录和表达。RT-PCR结果进一步显示,Vpr基因编码蛋白能够降低KSHV ORF26 mRNA转录水平。结论:成功构建含Vpr基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达;初步探索表明Vpr蛋白能够抑制KSHV溶解性周期复制。; 方欣卢春曹戌李久明秦娣吕志刚; 关键词：人类免疫缺陷病毒1型卡波济肉瘤相关疱疹病毒

HIV-1Rev基因编码蛋白在PEL细胞系中的表达及其表达蛋白抑制HHV-8溶解性周期复制被引量：4: 2008年; 目的:构建含人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of virion protein expression,Rev)编码基因的重组真核表达质粒并初步探索Rev基因编码蛋白对人类疱疹病毒8型(HHV-8)溶解性周期复制的影响。方法:构建pRev-Flag重组质粒并进行酶切鉴定和序列测定;将pRev-Flag重组质粒瞬时转染原发性渗出性淋巴瘤细胞系(PEL)BCBL-1细胞和小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3,采用RT-PCR、Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测Rev基因的表达情况;提取瞬时转染pRev-Flag重组质粒的BCBL-1细胞总RNA,进行RT-PCR检测HHV-8次要衣壳蛋白编码基因ORF26 mRNA转录水平。结果:核酸序列分析结果表明,克隆的Rev基因序列与GenBank中已登记的Rev序列100%同源,RT-PCR和Western blot都在Rev预期位置检测到特异性条带。RT-PCR检测显示,Rev基因编码蛋白能够降低HHV-8 ORF26 mRNA转录水平。结论:成功构建含Rev基因序列的重组质粒并在真核细胞中获得正确表达;初步探索表明Rev蛋白能够抑制HHV-8溶解性周期复制。; 李久明华立新冯宁翰曹戌吕志刚秦娣卢春; 关键词：人类免疫缺陷病毒1型人类疱疹病毒8型

KSHV包膜糖蛋白编码基因K8.1、K8.1A和gL的克隆及真核表达被引量：2: 2007年; 目的:克隆并在293T细胞中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白编码基因K8.1、K8.1A与gL。方法:以BCBL-1细胞总DNA为模板,用PCR方法扩增出K8.1和gL基因;以BCBL-1细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出K8.1A基因。将PCR产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,分别构建含K8.1、K8.1A和gL基因的重组真核表达质粒。重组质粒转染293T细胞,用Westernblot的方法检测K8.1和K8.1A在293T细胞中的表达;RT-PCR方法检测gL基因在293T细胞中的转录。结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的K8.1、K8.1A和gL基因与GenBank中已登记的KSHVK8.1、K8.1A和gL基因序列100%同源。Westernblot结果显示,在约35ku位置有目的条带,与预期的重组K8.1和K8.1A蛋白大小一致。RT-PCR结果显示约在500bp位置检测到特异性条带。结论:KSHVK8.1、K8.1A和gL编码基因在293T细胞中获得正确表达。; 徐华国卢春程林曾怡秦娣吕志刚陈秀英; 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒真核表达

HIV-1假病毒的构建及对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系的感染研究被引量：1: 2008年; 目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BCBL-1细胞的感染状况。方法:根据GenBank登记的VSV-GP基因核苷酸序列设计1对PCR引物,其5′端分别引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pHCMV-G为模板,PCR扩增VSV-GP基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pVSV-GP。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的HIV-1基因组重组质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染人胚肾HEK293T细胞,收获细胞进行Western blot,检测HIV-1p24蛋白的表达;收获HIV-1假病毒感染BCBL-1细胞,进行虫荧光素酶(Luciferase)报告基因活性检测以及用ELISA的方法检测感染后细胞上清中HIV-1p24蛋白的含量。结果:PCR分离、克隆的VSV-GP序列全长1536bp,序列经过核酸分析证实;Western blot在HIV-1p24蛋白预期位置检测到特异性条带;HIV-1假病毒感染BCBL-1细胞后上清可以检测到HIV-1p24蛋白,并且测得Luciferase活性值较对照组显著增高(P<0.05)。结论:成功包装了HIV-1假病毒,并且该病毒可以感染BCBL-1细胞。; 朱晓蕾卢春吕志刚秦娣; 关键词：卡波济肉瘤相关疱疹病毒

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吕志刚

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