庞蓉蓉
- 作品数：7 被引量：4H指数：1
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- 小鼠脑内星形胶质细胞体外培养方法的优化被引量：1
- 2012年
- 目的:优化小鼠脑内星形胶质细胞的体外培养方法,为星形胶质细胞的功能研究奠定实验基础。方法:取新生0～1 d的C57BL/6乳鼠大脑皮质,胰酶消化结合机械吹打方法,分离皮质细胞,制成细胞悬液并差速贴壁处理,待细胞接种24 h轻柔换液,以后每隔2～3 d换液,且每次换液前手动振荡洗涤2次,传代3次后,行胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫细胞化学染色及免疫荧光染色鉴定。结果:经过原代及传代培养,获得形态典型、纯度在95%以上的星形胶质细胞。结论:优化后的体外培养星形胶质细胞方法,稳定有效,操作简便易行,并可获得高纯度的星形胶质细胞。
- 刘晓梅赵聃庞蓉蓉单锴李妍王迎伟
- 关键词：星形胶质细胞小鼠细胞培养胶质纤维酸性蛋白
- 小鼠星形胶质细胞特异性启动子及其慢病毒载体
- 本发明涉及小鼠星形胶质细胞特异性启动子，特别涉及小鼠星形胶质细胞特异性启动子慢病毒载体的构建及其应用。小鼠星形胶质细胞特异性启动子，其特征在于所述的核苷酸序列为SeqNO.1。并提供所述的序列的小鼠星形胶质细胞特异性启动...
- 王迎伟单锴庞蓉蓉赵聃邱文
- 文献传递
- 大鼠补体C5a蛋白真核、原核表达载体的构建以及体外表达的鉴定、纯化和生物学活性分析被引量：1
- 2013年
- 目的:构建带His标签的大鼠补体C5a蛋白真核表达载体pIRES2-EGFP-C5a和原核表达载体pET-21a-C5a,分别观察其体外表达情况,将C5a蛋白纯化后分析其生物学活性。方法:以RT-PCR方法从大鼠肝细胞中扩增出大鼠补体C5a基因全长cDNA序列,在序列的N端添加6个组氨酸His标签后,插入含增强绿色荧光蛋白的真核表达质粒pIRES2-EGFP,用脂质体法转染HEK293细胞,免疫印迹法检测C5a蛋白的表达水平;以真核表达质粒pIRES2-EGFP-C5a为基础,将大鼠补体C5a基因亚克隆至原核表达载体pET-21a,体外检测C5a蛋白的表达情况,之后再行Ni2+螯合亲和层析柱纯化C5a蛋白。以C5a刺激中性粒细胞,流式细胞仪检测细胞内活性氧的生成;C5a刺激大鼠肾小球系膜细胞(GMC)不同时间,RT-PCR测定其产生IL-6和TNF-α的水平。结果 :RT-PCR扩增出了大鼠补体C5a基因;并成功构建了pIRES2-EGFP-C5a重组质粒,体外成功转染入HEK293细胞,并在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,但免疫印迹法未能检出C5a蛋白的表达;另成功构建了pET-21a-C5a原核表达载体,并在体外用免疫印迹法检测到了C5a蛋白表达。另用亲和层析纯化得到了带His标签的C5a蛋白,证实C5a能促进中性粒细胞呼吸氧爆发。结论:成功构建了大鼠补体C5a真核和原核表达载体。构建的原核表达载体可测到C5a蛋白的表达,且C5a蛋白具有相应的生物学活性。
- 季明德单锴庞蓉蓉赵聃王迎伟
- 关键词：补体C5A质粒构建生物学活性
- MiR-497调控Hif1α诱导EAE小鼠星形胶质细胞生成炎性因子的机制研究
- 第一部分 EAE模型小鼠脑组织和体外用IL-17刺激星形胶质细胞诱导下调的microRNA及其上调的Hif1α的表达分析目的:探讨EAE模型小鼠的脑组织和体外用IL-17刺激星形胶质细胞后,其microRNA(miRNA...
- 庞蓉蓉
- 关键词：星形胶质细胞缺氧诱导因子1ΑHIF1Α
- 文献传递
- 大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定被引量：1
- 2013年
- 目的 :构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding proteinβ,C/EBPβ)对该质粒基因启动子活性的影响。同时,筛选C/EBPβ与IL-6基因启动子区的结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列(-1 791～+30 nt),将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中。将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-IL-6-1)和大鼠野生型C/EBPβ表达质粒(pIRES2-EGFP-C/EBPβ)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBPβ对IL-6基因的启动作用。另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBPβ潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-IL-6-2～5)。将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBPβ过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBPβ的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功。将pGL3-IL-6-1和pIRES2-EGFP-C/EBPβ共转染HEK293细胞发现,IL-6基因启动子活性显著增加。另将pGL3-IL-6-1、pGL3-IL-6-2～5和pIRES2-EGFP-C/EBPβ共转染HEK293细胞后发现,pGL3-IL-6-5的启动活性显著低于其他组。提示C/EBPβ可能结合在IL-6基因启动子的-618 bp～-126 bp区域。结论:成功构建了大鼠IL-6基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出了C/EBPβ在IL-6基因启动子上的结合部位。
- 庞蓉蓉李妍张婧单锴邱文何风霞赵聃王迎伟
- 关键词：IL-6CCAAT启动子活性
- SOCS3基因3'端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及活性鉴定
- 2012年
- 目的:研究细胞因子信号抑制蛋白-3(suppressors of cytokine signaling-3,SOCS3)基因3'端非翻译区(3'-un-translated region,3'-UTR)微小RNA(microRNA,miRNA)的调控作用,构建重组SOCS3基因3'-UTR荧光素酶报告载体,并通过荧光素酶活性测定,初步分析可能调控SOCS3基因表达的miRNAs。方法:采用PCR方法从原代培养的小鼠星形胶质细胞基因组DNA中扩增SOCS3基因3'-UTR序列,插入荧光素酶报告载体pGL3-Promoter,获得重组载体pGL3-Promoter/SOCS3;通过Target Scan5.2、RNAhybrid和FINDTAR3软件预测可能与SOCS3基因3'-UTR结合的miR-NAs;将pGL3-Promoter/SOCS3重组质粒和miRNAs共转染HEK 293T细胞,测定SOCS3 3'-UTR荧光素酶的活性。结果:酶切及核酸测序证实,成功构建了SOCS3基因3'-UTR序列的荧光素酶报告重组子;miRNA靶位点预测显示,SOCS3基因可能是miR-203、miR-291a-5p、miR-9、miR-140和miR-130b的作用靶标;与对照组相比,miR-203、miR-291a-5p、miR-140能使SOCS3 3'-UTR荧光素酶的活性显著降低。结论:成功构建了SOCS3基因3'-UTR荧光素酶报告载体,且miR-203、miR-291a-5p、miR-140可显著降低其荧光素酶的活性。
- 刘晓梅庞蓉蓉赵聃李妍单锴王迎伟
- 关键词：微小RNA
- 大鼠野生型TRAF6基因和TRAF6 shRNA表达质粒的构建及鉴定被引量：1
- 2011年
- 目的:构建大鼠野生型肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)基因及其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达和沉默TRAF6基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠TRAF6基因的CDS区序列(加HA标签)和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGenesil-1/GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用NeonTM电转仪,将上述质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查HA-TRAF6融合蛋白的表达情况,同时筛选最有效的TRAF6shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析确证,上述TRAF6基因过表达和shRNA表达质粒均构建成功。Western blot显示,构建的pcDNA3.1-HA-TRAF6质粒能在大鼠GMC中表达,且TRAF6 shRNA-1具有最佳的沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型TRAF6真核表达质粒及其特异性的shRNA表达载体,这为今后进一步研究TRAF6基因的生物学功能提供了实验基础。
- 邱文单锴庞蓉蓉季明德王迎伟
- 关键词：肿瘤坏死因子受体相关因子6小发夹RNA肾小球系膜细胞
