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Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定被引量：8: 2010年; 目的利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区（DENV-1—4 ED Ⅲ），获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ。方法PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因，构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒。酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115，涂板后经G418梯度浓度筛选，获得多株抗G4184．0mg／ml的高拷贝菌株，扩大培养后，利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白，表达上清用Ni—NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定。结果成功构建pPIC9K—DENV-1～4 ED Ⅲ重组质粒，高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白，纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳，相对分子质量约为12×10^3，与实际相符。免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合。结论成功通过毕赤酵母高效分泌表达I～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白，这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究。; 蔡建飘钱菲王嘉颖赵莹徐晓晶金维荣车小燕; 关键词：登革热病毒毕赤酵母基因表达调控病毒

肝癌中高通量RNA干扰技术及其应用被引量：1: 2010年; 目的:探讨国内外高通量RNA干扰(RNAi)的技术方法,及其在寻找新的肝癌靶点和治疗方法上的应用。方法:检索Medline及CNKI期刊全文数据库检索系统,以"RNA干扰技术、肿瘤"等为关键词,检索1999-01-2010-12的相关文献。纳入标准:1)高通量筛选;2)药物靶点;3)肝癌。剔除与动物体内实验相关以及技术内容陈旧的文献。根据纳入、剔除标准分析39篇文献。结果:高通量的RNAi技术是一种良好的基因组水平功能性研究工具,可以通过研究肝癌细胞表型来研究基因的内在功能。肝癌病因复杂、易转移,且中国肝癌患者众多,亟待运用高通量的RNAi技术发现针对肝癌新的药物靶点以及更有效的治疗方法。结论:通过文献归纳出,国内外尤其中国在高通量RNA干扰技术在肝癌研究中研究有限,因此运用此技术进行肝癌新的药物靶点和治疗手段的研究具有巨大潜力和重要意义。; 徐晓晶殷弘为; 关键词：肝肿瘤 RNA干扰

碳酸酐酶Ⅱ基因克隆及在毕赤酵母中的异源表达: 2015年; 碳酸酐酶Ⅱ(carbonic anhydraseⅡ,CAⅡ)是参与机体多种代谢活动和病理活动的一种重要催化酶。通过基因重组、电转化等方式,得到能异源高表达人CAⅡ的毕赤酵母(Pichia.pastoris)GS115工程菌。对工程菌进行培养及甲醇诱导后,经离子交换层析柱分离纯化后得到较纯的重组CAⅡ。通过Western blotting、酶活力及圆二色谱检测发现重组和商品化CAⅡ具有相似的酶活力和构象,为CAⅡ今后进一步在临床的研究和工业应用打下了基础。; 卫玲赵莹徐晓晶; 关键词：毕赤氏酵母异源表达

骨髓间充质干细胞的分离鉴定及向血管内皮细胞诱导分化过程中microRNA126的表达: 2013年; 目的建立分离大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSCs）及将其定向诱导分化为血管内皮细胞（endothelialcells，EDCs）的方法，并通过观察microRNAl26的表达规律初步探索其在定向分化中的调控作用。方法通过反复贴壁及人工分选方法进行大鼠骨髓MSCs的体外分离纯化及扩增，运用免疫荧光法检测MSCs中CD34、CDl05和CD73的表达。应用MEF诱导分化培养液将MSCs定向诱导分化为EDCs，采用qRT—PCR法检测细胞诱导分化过程不同时间点EDCs特征基因CD34、血管内皮钙黏蛋白（VE—cadherin）及调控小RNA分子microRNAl26的表达。结果经分离纯化的骨髓MSCsCD34呈阴性表达，CDl05呈强阳性表达，CD73呈阳性表达，证实骨髓MSCs分离成功，且细胞均一性较好，占细胞总数的90％以上。MSCs定向诱导为EDCs早期分化过程中，在诱导前期第1～4天，VE-cadherin和CD34基因呈阴性表达；第5～6天VE-cadherin和CD34表达显著；第7～9天，VE-cadherin呈持续阳性表达，而CD34于第7天下降，第8～9天又呈阳性表达。microRNAl26在分化过程中的表达趋势与CD34一致。结论成功建立了骨髓MSCs的分离方法及定向诱导分化为EDCs的方法；microRNAl26在MSCs向EDCs的定向分化过程中可能起一定的调控作用。; 吴弘徐晓晶吴峰储国俊赵仙先秦永文; 关键词：骨髓间充质干细胞内皮细胞细胞分化

GSTM3过表达或沉默的乳腺癌细胞株MDA-MB-231的构建: 2009年; 为深入研究谷胱甘肽S-转移酶μ3(glutathione S-transferase M3,GSTM3)在乳腺癌中的作用,构建了真核重组表达质粒pcDNA3.1/GSTM3,并利用真核表达载体pSilencer2.1U6-neo构建GSTM3特异性siRNA表达载体.重组质粒转染MDA-MB-231细胞,半定量、荧光定量RT-PCR和Western blot对转染细胞的检测结果表明,转染GSTM3基因真核表达质粒的细胞株中GSTM3表达明显提高,而转染siRNA表达质粒后,GSTM3的表达则受到显著抑制.; 黄秋梅徐晓晶阳国平赵莹周玲王嘉颖袁洪金维荣; 关键词：乳腺癌 RNA干扰

人血清脂联素定量ELISA检测方法的建立及初步临床应用被引量：4: 2009年; 目的:建立一种检测人血清中脂联素(APN)的酶联免疫吸附方法(ELISA),并初步探讨其在冠心病诊断中的应用。方法:构建表达质粒pET22b(+)/gAPN,在原核表达系统大肠杆菌中表达并纯化重组脂联素球状区(gAPN)蛋白。用抗APN单克隆抗体MAB10651包被微孔板,10%小牛血清作为封闭液,针对APN不同抗原表位的单克隆抗体MAB1065生物素化后作为标记抗体,联合生物素-亲和素信号放大系统,以gAPN重组蛋白为标准品绘制标准曲线,以准确性、特异性、重复性、回收率试验和方法对比试验评价ELISA方法。检测161例冠心病患者血清APN水平并结合冠状动脉造影结果和Gensini积分系统,探讨血清APN水平与冠心病的关系。结果:利用基因克隆技术成功构建了pET22b(+)/gAPN质粒,获得了相对分子质量约15000的重组gAPN蛋白,产量较高(1.57mg),纯度>90%,并以此为标准品初步建立了检测人血清APN的定量ELISA方法。该法具有良好的准确性和重复性,灵敏度达150pg/ml,回收率为91.0%～108.0%,与深圳依诺金生物科技有限公司进口分装的ELISA试剂盒对照比较有良好的相关性(r=0.935,P<0.001)。临床检测表明冠心病组血清APN水平明显低于非冠心病组(P<0.01),且血清APN水平随冠状动脉狭窄程度的加重呈进行性下降趋势。结论:本实验成功建立了一种简便快速检测人血清APN的ELISA方法,对诊断冠心病有临床应用价值,为国内APN诊断试剂盒的研制和开发提供了科学实验依据。; 李登清陈琳磊何笑恬卫玲曹琳曹洁徐晓晶袁洪金维荣; 关键词：脂联素酶联免疫吸附测定血清学诊断冠心病

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徐晓晶

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