袁献温
- 作品数：14 被引量：24H指数：3
- 供职机构：南京大学医学院附属鼓楼医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学更多>>
- 构建Tet-on调控稳定表达肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-4的人类MSCs细胞株被引量：2
- 2015年
- 目的:通过慢病毒转染UE7T-13细胞,构建Tet-on基因开关调控稳定表达肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、成纤维细胞生长因子-4(fibroblast growth factor 4,FGF4)的人类骨髓间充质干细胞株.方法:全基因合成HGF和FGF4序列,通过酶切、重组分别构建包含目的基因HGF、FGF4的两个慢病毒载体plenti6.3/TO-HGF和plenti6.3/TO-FGF4,包装并计算其滴度.以U E7T-13细胞最适M O I值稀释慢病毒Lenti3.3/T R,并转染U E7T-13细胞,加入抗生素Zeocin筛选,获得带有Tet-on基因调控开关的UE7T-13-TR细胞株.采用已构建好的慢病毒plenti6.3/TO-HGF和plenti6.3/TOF G F4分别转染U E7T-13-T R细胞并经过抗生素Blasticidin筛选,构建Tet-on调控稳定表达HGF的UE7T-13-TR-HGF细胞株和Tet-on调控稳定表达FGF4的UE7T-13-TR-FGF4细胞株.通过Q-PCR、Western blot及ELISA在基因、蛋白及蛋白分泌水平检测目的基因HGF、FGF4的表达情况.结果:成功构建UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TR-FGF4细胞株.经Q-PCR检测,当Tet存在时,HGF基因在UE7T-13-TR-HGF中的表达为无Tet时的78倍;FGF4基因则超过2万倍,且1μg/m L的Tet为较佳浓度.Western blot及ELISA结果在蛋白表达水平及蛋白分泌水平验证了以上结果,证明已合成的HGF及FGF4能成功分泌到细胞外.结论:通过慢病毒转染UE7T-13细胞,我们成功构建出Tet可调控稳定表达HGF、FGF4细胞株(UE7T-13-TR-HGF和UE7T-13-TRF G F4细胞株),为进一步的研究奠定了良好的实验基础.
- 肖江强施晓雷袁献温丁义涛
- 关键词：诱导分化基因开关人肝细胞
- 一种便携式智能泌乳素检测仪及检测系统
- 本发明公开了一种便携式智能泌乳素检测仪及检测系统，外壳的表面设置有显示屏，卡口的内部与电极相连，外壳的表面固定连接有安装块，安装块的内侧活动安装有采血针，还包括泌乳素检测部件，泌乳素检测部件包括设置在外壳内部的电池仓、传...
- 毕艳张芃子袁献温
- 骨髓间充质干细胞对急性肝衰竭的治疗作用及机制被引量：7
- 2017年
- 目的探索骨髓间充质干细胞（MSCs）分泌的炎症相关因子及其对急性肝衰竭（ALF）的治疗作用。方法获取并鉴定sD大鼠MSCs。收集MSCs条件培养基（MSCs—CM）检测炎症相关因子。SD大鼠分为三组：ALF＋达尔伯克氏改良伊格尔培养基（DMEM）组：D－氨基半乳糖（D—Gal）诱导大鼠ALF后静脉输注DMEM 1ml；ALF＋MSCs组：诱导ALF后静脉输注MSCs 1ml（约1×10^6）；ALF＋MSCs—CM组：诱导ALF后静脉输注MSCs—CM 1ml。检测各组大鼠生化指标、4周存活率、组织病理学和炎症因子水平。评估直接输注外源性重组大鼠白介素10（IL-10）与给予抗白介素10抗体后输注MSCs-CM对ALF大鼠转氨酶的影响。检测给予IL—10后ALF大鼠肝脏磷酸化STAT3（pSTAT3）水平，评估AG490（STAT3信号通路抑制剂）能否逆转IL-10的治疗作用。结果ALF＋DMEM组、ALF＋MSCs组和ALF＋MSCs—CM组给予D—Gal第3天血清ALT分别为1709．8±372．1、865．5±52．8、964．7±414．6U／L，AST分别为4234．0±807．3、2440．8±511．9、2739．8±587．3U／L，TBil分别为79．3±10．9、43．8±7．0、61．2±6．7μg／L。三组28天存活率分别为10．0％、80．0％、70．0％；炎症因子干扰素（IFN-γ）分别为69．8±4．7、46．4±4．3、54．6±2．4pg／ml，IL-113分别为58．5±7．6、40．5±6．9、44．1±6．0pg／ml，IL-6分别为71．9±16．1、38．4±7．7、45．3±9．0pg／ml，IL-10分别为38．3±6．0、75．4±11．1、59．6±11．9pg／ml。蛋白芯片检测提示MSCs-CM表达多种炎症相关细胞因子，其中IL-10的水平最为显著。与ALF组（ALT：1709．8±372．1U／L，AST：4234．0±807．3U／L）比较，单独使用IL-10（ALT：1126．9±419．3U／L，AST：2370．8±561．2U／L）能显著降低转氨酶水平，同时给予抗IL-10抗体（ALT：1568．5±325．4U／L，AST：4043．7±819．0U／L）则能中和ISCs-CM（ALT：964．7±414．6U／L，AST：2739．8±587．3U／L）的治�
- 马虎成王鑫吴旻娜袁献温施晓雷
- 关键词：骨髓间充质干细胞急性肝衰竭条件培养基免疫调节STAT3信号通路
- 中性粒细胞在骨髓间充质干细胞治疗D-氨基半乳糖诱导急性肝衰竭大鼠中的作用被引量：3
- 2016年
- 目的 观察骨髓间充质干细胞（MSCs）移植对D-氨基半乳糖（D—GalN）诱导SD大鼠急性肝衰竭模型的治疗作用并探索中性粒细胞在其中的机制关联。方法将39只雄性SD大鼠分为4组：对照组（／7=8，腹腔注射等渗盐水）、模型组n=10，腹腔注射D—GaIN）、溶剂组n=9，腹腔注射D-GalN后2h尾静脉注射等渗盐水）及治疗组（n=12，腹腔注射D—GaIN后2h尾静脉注射MSCs）。建立D-GaIN诱导急性肝衰竭模型后24h处死大鼠，分别收集血液及肝脏组织，检测血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和总胆红素，血液分析大鼠外周血中性粒细胞数量及比率，免疫荧光检测肝脏中性粒细胞标志物Ly6g表达水平，髓过氧化物酶（MPO）试剂盒检测肝脏MPO活性，RT—PCR检测肝脏组织炎性因子及趋化因子肿瘤坏死因子。a、白细胞介素1β、干扰素Y、白细胞介素10、CXC趋化因子配体1、CXC趋化因子配体2的mRNA水平；另将64只雄性SD大鼠随机分组后连续7d观察各组大鼠生存率。两两组间比较应用独立样本t检验（经Levene方差齐性检验，当JD〈0．05时，采用校正f检验）；大鼠生存分析采用两两比较的Logrank检验。结果D-GaIN诱导的急性肝衰竭SD大鼠24h后反映肝功能的生物化学指标显著升高[丙氨酸氨基转移酶：（2884．1±541．0）U／L与（45．4±11．0）U／L，P〈0．001；天冬氨酸氨基转移酶：（3634．9±755．9）U／L与（143．9±23．7）U／L，P〈0．001；总胆红素：（44．4±8．4）μmmol／L与（0．9±0．2）ummol／L，P〈0．001]外周血中性粒细胞数量与比率大幅上升[数量：（4．7±1．1）×10^9与（1．4±0．4）×10^9，P〈0．001；比率：44．9％±8．0％与18．3％±4．4％，P〈0．001）；肝脏组织中性粒细胞大量聚集，MPO活性[（4．72±1．09）U／g与（1．13±0．24）U／g，P〈0．001]、炎性因子及趋化因子均明显增多。MSCs移植�
- 赵鑫施晓雷张志恒马虎成袁献温丁义涛
- 关键词：肝功能衰竭间充质干细胞中性粒细胞
- 肝脏类器官构建及其对小鼠部分肝切除术后肝再生的作用被引量：1
- 2020年
- 目的观察肝脏类器官对小鼠部分肝切除术后肝再生的作用。方法体外构建肝脏类器官,通过形态学、PCR和免疫荧光对类器官进行初步鉴定。C57BL/6小鼠随机等分为对照组和治疗组,每组18只。对照组进行肝左叶、中叶切除术+肝包膜注射200μL PBS;治疗组进行肝左叶、中叶切除术+肝包膜移植200μL类器官悬液。建模成功后分别于术后第1、4、7天收集标本。通过血清生化检测、免疫组化和Western blotting评估肝脏类器官对小鼠肝部分切除术后肝再生的作用。结果类器官体外培养3 d,从直径20μm的囊性结构扩增到约125μm的细胞团(P<0.05),直径扩增近6倍。肝脏干细胞标志基因EPCAM、SOX9和CK19明显上调(P<0.05),传代前后基因保持稳定。免疫荧光显示CK8、Desmin、AFP和PCNA呈阳性。HE显示术后第4天,治疗组肝细胞形态大小基本恢复正常,形态较清晰,无炎症细胞浸润,无脂肪或气球样变。对照组小鼠肝细胞核仁染色加深,仍有炎性细胞浸润,部分区域存在肝细胞坏死区。免疫组化Ki67和Western blotting对增殖水平进行检测,结果显示治疗组增殖能力是对照组的3倍。肝功能检测发现治疗组在术后第4天ALT、AST、TBIL和DBIL明显下降,ALB合成增加(P<0.05)。结论具有肝脏干细胞属性和增殖能力的肝脏类器官,能通过保护肝细胞、改善部分肝切除术后小鼠肝功能,发挥促进肝再生作用。
- 薛瑞丰汤宁汤宁董春龙蔡佳晖袁献温袁献温任昊桢任昊桢
- 关键词：肝部分切除术肝再生小鼠
- 猪骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养的比较蛋白质组学研究被引量：1
- 2014年
- 目的 比较猪骨髓间充质干细胞（MSCS）与原代肝细胞构建共培养体系前后肝细胞内蛋白质表达谱的差异.方法 体外建立肝细胞与MSCS最适共培养体系.流式细胞仪分选共培养肝细胞）,并设立肝细胞、MSCS单纯培养组作为对照.采用双向凝胶电泳分离后,将差异蛋白点进行胶内原位切割、酶解后,获得肽质指纹谱.并通过Western blot技术进一步验证.结果 经质谱鉴定出34个蛋白点,Western blot检测证实囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）、白细胞介素（IL）-6、人高迁移率族蛋白（HMG）-1变化水平与蛋白质组结果基本一致.结论 这些功能蛋白的差异表达可能与MSCS和原代肝细胞体外共培养下肝细胞特异性功能改善、细胞生存时间延长、免疫调节存在必然联系.
- 顾劲扬施晓雷袁献温张悦肖江强丁义涛
- 关键词：猪肝细胞骨髓间充质干细胞共培养蛋白质组
- 白介素-10和转化生长因子-β1基因共修饰骨髓间充质干细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究
- 目的探讨白介素-10(IL-10)和转化生长因子-β1(TGF—β1)基因共修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠移植肝脏免疫耐受的诱导及效果。方法行SD大鼠为供体,近交系Wistar大鼠为受体建立同种异体原位肝移植40...
- 郑圣斌施晓雷韩冰任昊桢袁献温马虎成王俊丁义涛
- 猪内源性逆转录病毒透过生物人工肝的影响因素被引量：3
- 2012年
- 目的病毒安全性是猪源性生物人工肝（BAL）不可忽略的安全问题。本研究旨在探讨影响BAL中猪内源性逆转录病毒（PERV）透过的因素。方法构建双循环的新型猪源性BAL。两循环间采用膜孔径为10nm、20nm、30nm和35nm的血浆成分分离柱以及500nm膜孔径的血浆过滤柱分隔两循环。反应器内填充共培养的猪肝细胞-骨髓间充质肝细胞或原代猪肝细胞并连续循环72h。每12h抽取内、外循环内培养液检测PERVRNA、逆转录酶（RT）活性以及其体外感染性。结果血浆过滤柱组中，内外循环内PERV检测结果完全相同，提示500nm血浆滤过柱对PERV并无阻隔作用。在血浆成分交换柱各组中，各时间点内循环中均能检出RNA和RT活性，但是外循环中并未检出RT活性，而且随着膜孔径减小，RNA的检出时间逐渐延迟，且内循环RNA水平逐渐增加。各培养液均未发现能够体外感染HEK293细胞。结论膜孔径、循环时间以及内循环病毒浓度是影响BAL中PERV透过的主要原因。
- 韩冰施晓雷袁献温肖江强张悦檀家俊顾忠泽丁义涛
- 关键词：猪内源性逆转录病毒生物人工肝膜孔径
- 仿生电刺激在体外促进人骨髓间充质干细胞株向肝细胞分化的研究
- 2014年
- 目的 探讨仿生电刺激体外诱导人骨髓间充质干细胞株（UE7T-13）向肝细胞分化的作用.方法 采用静电纺丝及氧化聚合法制备聚吡咯/PLGA导电膜,并在其表面培养UE7T-13细胞株.实验按是否给予诱导因子及施加电刺激分为四组：电刺激＋诱导因子组、电刺激组、诱导因子组以及空白对照组.诱导因子包括HGF、EGF、FGF及OSM等.电刺激为每日给予频率5Hz、脉宽5 ms、电压100 mV（电流强度100 μA）的仿生电刺激2h.每天常规收集培养液,检测其中白蛋白分泌、尿素合成、细胞色素P450活性.MTT法检测细胞增殖能力,细胞免疫荧光方法检测各组干细胞中白蛋白和甲胎蛋白的表达.结果 电刺激＋诱导因子组及诱导因子组UE7T-13细胞均成功诱导出类肝样细胞.与单纯诱导因子组比较,电刺激＋诱导因子组UE7T-13更早向肝细胞转化,其肝细胞特异功能表达及表面特异蛋白分子表达更强.UE7T-13细胞在有电刺激存在时增殖能力明显提高.结论 仿生电刺激可促进体外UE7T-13细胞增殖及其肝向分化,使其更早出现肝细胞特异性分子表达,并提高分化效率.
- 褚薛慧冯章启许茜袁献温李强孙喜太肖江强丁义涛
- 关键词：电刺激骨髓间充质干细胞肝细胞分化
- CXCR4转染的骨髓间充质干细胞靶向治疗急性肝衰竭被引量：2
- 2014年
- 目的:提高骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)移植治疗急性肝衰竭时在肝脏的定植率及疗效.方法:采用慢病毒转染使MSC过表达CXCR4基因,RT-PCR和细胞流式检测CXCR4表达.ELISA实验检测肝衰竭裸鼠肝脏MSC向基质衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)水平.迁移实验检测转染的SDF-1α趋化能力.20%(V/V)四氯化碳(CCl4)橄榄油溶液8μL/g腹腔注射诱导裸鼠急性肝衰竭模型,24 h后尾静脉注射CXCR4转染的间充质干细胞(CXCR4-MSC)和未转染的间充质干细胞(Null-MSC).于注射后各时间点活体示踪MSC分布情况、裸鼠肝功能、生存率、组织病理学改变和肝细胞增殖情况.结果:CXCR4-MSC高表达CXCR4基因和CXCR4蛋白,肝衰竭裸鼠肝脏SDF-1α水平升高,与正常裸鼠相比有统计学差异.体外迁移实验证实CXCR4-MSC比Null-MSC具有向SDF-1α更好的迁移能力.体内活体成像显示移植后5 d CXCR4-MSC主要定植在肝脏,而Null-MSC在肝脏和脾脏都有定植.高定植率使得转染组裸鼠比未转染组裸鼠肝细胞受损更轻且具有更长的生存期,同时转染组裸鼠肝细胞增殖明显多于未转染组,两者有统计学差异.我们的实验证实转染CXCR4基因的骨髓间充质干细胞能够更好地促进肝再生.结论:基因修饰使骨髓间充质干细胞过表达CXCR4基因能够促进干细胞在肝脏的定植,改善肝功能,提高肝细胞的再生和裸鼠的生存率,为干细胞移植治疗肝功能衰竭提供了更广阔的应用途径.
- 马虎成施晓雷任昊桢袁献温丁义涛
- 关键词：急性肝衰竭细胞移植趋化因子受体4基因修饰
