赵沙沙
- 作品数：6 被引量：8H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金重庆市卫生局科研项目更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 肺炎链球菌Dnaj蛋白质的初步晶体学和功能研究
- 背景：肺炎链球菌是一种条件致病菌，已成为社区感染的重要病原菌之一。Dnaj属于肺炎链球菌的热休克蛋白40(HSP40)家族成员，在蛋白的折叠、转运等过程中扮演着重要的角色。该蛋白的活性位点及其作用机制，可以为我们寻找新的...
- 赵沙沙
- 关键词：肺炎链球菌
- 重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白的原核表达、纯化及鉴定被引量：2
- 2012年
- 目的:表达和纯化重组葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性。方法:利用重叠延伸PCR方法使基因重组获得目的基因片段,插入带有GST标签的原核高效可溶性表达载体pEGX-6P-1中,构建重组表达质粒pEGX-6P-1-SAK-HC,将重组表达质粒转化大肠杆菌B834,经IPTG诱导目的蛋白表达;对融合蛋白用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱(GST)亲和层析柱及DEAE离子交换柱纯化,用PreScission蛋白酶切除GST标签,SDS-PAGE分析该融合蛋白的表达量和纯度,应用纤维蛋白平板溶圈法测定评价其生物学活性。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实,目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量(Mr)为36 000;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为9.4×104IU/mg。结论:获得了可溶性的葡激酶-人HC蛋白融合蛋白,且其纤溶活性与尿激酶标准品相当。为下一步进行融合蛋白免疫原性鉴定奠定了基础。
- 陈检杨可郭珍张阳丽张绍城杨伟赵沙沙何泉汪德强周建中
- 关键词：重组葡激酶融合蛋白表达纯化体外活性
- 重组肺炎链球菌甘油脱氢酶活性及晶体培养的初步分析
- 2012年
- 甘油脱氢酶能够氧化胞内甘油为代谢活动提供能量,并参与调控宿主粘附相关细菌蛋白质的表达,是潜在的抗菌药物靶点.本文利用大肠杆菌BL21原核表达肺炎链球菌甘油脱氢酶,获得大量上清表达的目的蛋白.再用Ni-NAT-Sepharose Fast Flow亲和层析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析以及Superdex 200分子筛进行纯化.经数据拟合,证实该酶在溶液中以同源二聚体形式存在.光谱实验证实,该重组表达甘油脱氢酶仍具有氧化甘油生成1,3-二羟基丙酮的活性.用Hampton试剂盒初筛晶体及棋盘法优化晶体,在0.1 mol/L Bicine pH 9.6,13%PEG MME 5000,0.2 mol/L KSCN,4%Dioxone条件下,得到了晶型好且有一定衍射能力的单晶,为解析肺炎链球菌甘油脱氢酶的三维结构及研究结构与酶活之间的关系奠定了基础.
- 赵沙沙牛司强金丽杨伟汪德强
- 关键词：肺炎链球菌甘油脱氢酶蛋白表达纯化
- 肺炎链球菌假想转录因子LytR的表达、纯化、晶体生长及优化被引量：2
- 2013年
- 本研究通过大量表达、纯化肺炎链球菌(S.pn)假想转录因子LytR,以用于晶体生长、优化及三维结构解析。以S.pn D39血清型LytR基因为DNA模板、pET-32a(+)为表达质粒、E.coli BL 21(DE 3)为表达菌株,经成功克隆、表达及纯化后,获得大量、上清表达,且纯度>90%的LytR重组蛋白(含His标签);经悬滴气相扩散法行蛋白晶体培养、初筛及优化,获得体形较大、外观规则的棒状晶体,该晶体X射线衍射能力达4.0A。本研究为假想转录因子LytR三维结构的解析及其生物学研究奠定基础。
- 闵迅钟文赵沙沙董杰董珊珊周爱娥闫文娟汪德强
- 关键词：肺炎链球菌蛋白质纯化
- 一种新的抗菌药物靶标蛋白质(3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶)的克隆、表达、纯化及酶活性鉴定
- 2012年
- 【目的】核黄素(vitamin B12,riboflavin)是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前体物,对生物体的生物合成至关重要。如果细菌不能够从外界摄取足够的黄素(flavin)就需要自身合成核黄素以维持菌体的生存与增殖。3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase,DHBPs)为核黄素生物合成途径中关键酶之一。在镁离子存在的情况下,DHBPs将5-磷酸核酮糖(ribulose-5-phosphate,Ru5P)转换成3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-Bu-tanone-4-Pho-sphate,DHBP)和甲酸盐(formate),生成的DHBP为核黄素合成的必需原料之一。人类没有合成核黄素的相关途径,因此细菌参与合成核黄素的DHBPs等相关酶就有望成为抗菌药物作用的靶位点。本课题通过对肺炎链球菌的DHBPs进行克隆表达纯化与酶学性质鉴定,为开展其三维结构的解析和抗菌药物设计提供重要的工作基础。【方法】利用PCR技术扩增DHBPs基因,构建重组表达载体pW28-DHBPs。将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达,用Ni离子亲和层析及离子交换(DEAE)纯化获得有活性的DHBPs后,进行酶学性质鉴定。【结果】酶切和测序证实成功构建了质粒pW28-DHBPs,在E.coli BL21中表达了可溶性DHBPs,纯化后获得了纯度为95%的靶蛋白质,经分子筛分析DHBPs在溶液中以二聚体形式存在。对DHBPs进行酶学性质分析表明,在25℃、pH为7.5和Mg2+存在的情况下,DHBPs具有将5-磷酸核酮糖转换成DHBP和甲酸盐的活性。【结论】第一次成功克隆并在E.coli BL21中表达了一种肺炎链球菌合成核黄素的相关酶—DHBPs,纯化后的重组DHBPs具有较好的5-磷酸核酮糖分解活性,这为解析其三维结构和基于结构进行的新一代抗菌药物设计提供重要的工作基础。
- 金丽周华赵沙沙杨伟牛司强汪德强
- 稀有密码子对人源Id2基因表达的影响被引量：4
- 2013年
- 目的:通过对人Id2基因的稀有密码子进行突变并构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌(escherichia coli,E.coli)中表达Id2蛋白,分析稀有密码子对Id2基因表达的影响。方法:PCR扩增突变Id2基因序列,然后转入E.coli BL21中进行表达,利用镍离子亲和层析、离子交换层析及分子筛纯化。结果:正确构建了Id2基因的基因突变表达质粒,基因突变表达的Id2蛋白在E.coli BL21中为可溶性上清表达,成功纯化了目的蛋白,且分子筛结果显示其在溶液中呈现二聚体状态。结论:稀有密码子对Id2蛋白在E.coli BL21中大量可溶性上清表达有重要影响。
- 杨伟周华赵沙沙金丽郭珍张绍城陈检汪德强
- 关键词：ID2突变纯化
