孔祥民
- 作品数：8 被引量：17H指数：3
- 供职机构：江苏大学临床医学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省普通高校研究生科研创新计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- Toll样受体4增强β2糖蛋白1免疫小鼠B细胞的活化被引量：1
- 2015年
- 目的探讨Toll样受体4(TLR4)在β2糖蛋白Ⅰ(β2GP1)免疫的小鼠中,对B细胞活化过程的影响。方法将C3H/HeN(TLR4正常型)和C3H/HeJ(TLR4缺陷型)2种小鼠随机分为β2GP1免疫组和生理盐水对照组,分别注射β2GP1或等量的生理盐水进行免疫。采用皮下多点注射进行初次免疫,2次腹腔注射加强免疫,最后冲击免疫的方法免疫小鼠。采用间接ELISA检测小鼠血清中抗β2GP1抗体的效价;HE染色观察小鼠脾脏生发中心数量及大小的变化;免疫组织化学法观察脾脏生发中心内的CD40配体(CD40L)表达;流式细胞术检测小鼠脾脏B淋巴细胞中共刺激分子CD80和CD86的水平变化。结果经β2GP1免疫后,2种小鼠血清中均出现高效价的抗β2GP1抗体,且C3H/HeN血清效价高于C3H/HeJ小鼠。与生理盐水对照组相比,2种小鼠经β2GP1刺激后,CD40L、CD19+CD80+细胞和CD19+CD86+细胞的数量均显著增加;但C3H/He J小鼠CD40L,CD19+CD80+细胞和CD19+CD86+细胞的数量低于C3H/He N小鼠。经β2GP1刺激的小鼠脾脏生发中心,比生理盐水组更大更多,C3H/HeN小鼠的生发中心的数量多于C3H/HeJ小鼠。结论 TLR4增强β2GP1免疫小鼠B细胞的活化。
- 成思周红解鸿翔孔祥民谢娅超何超于尹婧夏龙飞
- 关键词：抗磷脂综合征B细胞生发中心TOLL样受体4
- β2糖蛋白Ⅰ免疫小鼠对辅助性T细胞亚群分化的影响
- 2015年
- 目的探讨β2糖蛋白I(β2GPI)免疫小鼠引起的辅助性T(Th)细胞分化和抗β2GPI抗体产生的机制。方法将健康的BALB/c小鼠随机分为生理盐水组和β2GPI免疫组,每隔2周由尾静脉注射β2GPI或等量生理盐水,共注射2次或4次。采用间接ELISA检测小鼠血清中抗β2GPI抗体的效价;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠脾脏细胞GATA结合蛋白3(GATA3)、白细胞介素4(IL-4)、表达于T细胞的T盒(T-bet)、γ干扰素(IFN-γ)、Foxp3的mRNA水平;流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞中GATA3阳性细胞和Foxp3阳性细胞的比例。结果 2次免疫后,小鼠血清中出现高效价(1∶100 000)的抗β2GPI抗体,脾脏中Th2特异性指标GATA3、IL-4的mRNA水平和GATA3阳性细胞比例相对生理盐水组升高。4次免疫后,小鼠血清中抗β2GPI抗体效价进一步升高(>1∶100 000),脾脏GATA3、Th1细胞特异性标志物(T-bet、IFN-γ)和调节性T细胞特异性标志Foxp3的mRNA水平下调,IL-4的mRNA水平和2次免疫后无明显差异。此外,脾脏细胞中GATA3阳性细胞的比例进一步上调且伴有Foxp3阳性细胞比例的下调。结论β2GPI免疫小鼠引起Th细胞向Th2细胞优势分化,并伴有Th1细胞和调节性T细胞的抑制,有利于抗β2GPI抗体的产生。
- 何超周红解鸿翔谢娅超孔祥民成思于尹婧夏龙飞
- 关键词：抗磷脂综合征Β2糖蛋白I细胞因子辅助性T细胞
- Toll样受体4在抗β_2GPⅠ-β_2GPⅠ复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达炎症因子中的作用被引量：4
- 2014年
- 目的观察抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物刺激小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-α、IL-1β、IL-6的效果,探讨Toll样受体4(TLR4)在其中的作用。方法对C3H/He N(TLR4正常)小鼠、C3H/He J(TLR4缺陷)小鼠腹腔注射非特异性兔Ig G(R-Ig G)、抗β2GPⅠ抗体,72 h后用细胞免疫荧光法检测小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的表达水平;抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物对小鼠腹腔巨噬细胞进行体外刺激,荧光定量PCR法检测细胞表达上述因子的mRNA水平,western blot法检测其蛋白质分泌水平。结果抗β2GPⅠ抗体刺激的C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1β、IL-6的水平明显高于C3H/He J小鼠,并经细胞免疫荧光法验证;经体外刺激后,荧光定量PCR法结果显示抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物诱导C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达水平高于空白组或C3H/He J刺激组(P均<0.01);western blot结果显示C3H/He N来源细胞TNF-α、IL-1β、IL-6分泌均显著高于C3H/He J来源细胞(P均<0.01)。结论抗β2GPⅠ-β2GPⅠ复合物能够促进小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,TLR4为介导此过程的受体之一。
- 孔祥民周红解鸿翔谢娅超何超成思于尹婧夏龙飞
- 关键词：TOLL样受体4小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子
- 阻断TLR2结合降低β2GP1-抗β2GP1复合物刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的表达被引量：1
- 2016年
- 目的探讨β2糖蛋白1(β2GP1)-抗β2GP1复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达肿瘤坏死因子α(TNF-α)中Toll样受体2(TLR2)的作用。方法用β2GP1-抗β2GP1复合物、TLR2激动剂Pam3CSK4及TLR4激动剂脂多糖(LPS)、TLR2阻断剂抗小鼠TLR2-Ig G(m TLR2-Ig G)及TLR4阻断剂TAK-242对BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞进行体外处理。用实时荧光定量PCR检测TNF-αmRNA水平,Western blot法及免疫荧光细胞化学方法检测TNF-α蛋白表达;采用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞表面TLR2的水平。结果β2GP1-抗β2GP1复合物、Pam3CSK4及LPS均能够显著增加BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞表达TNF-αmRNA及蛋白水平,抗m TLR2-Ig G能够抑制上述刺激物促进细胞TNF-α表达的效应,但弱于TAK-242的抑制效应,抗m TLR2-Ig G与TAK-242联合使用未显示更强的抑制效应。流式细胞术结果显示,β2GP1-抗β2GP1复合物、Pam3CSK4及LPS均能增加小鼠腹腔巨噬细胞TLR2的表达,而抗m TLR2-Ig G、TAK-242以及二者联合使用均未显示对TLR2表达的抑制效应。结论TLR4、TLR2都增强β2GP1-抗β2GP1复合物对小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的刺激作用。
- 于尹婧周红夏龙飞孔祥民谢娅超解鸿翔何超成思
- 关键词：抗磷脂综合征TOLL样受体2小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子Α
- Toll样受体4在抗β_2GPⅠ抗体诱导小鼠血管表达黏附分子及组织因子中的作用被引量：2
- 2015年
- 目的探讨Toll样受体4(TLR4)在抗β2糖蛋白Ⅰ(β2GPⅠ)抗体诱导小鼠动脉血管黏附分子及组织因子(TF)表达中的作用。方法腹腔注射抗β2GPⅠ抗体,分别刺激C3H/He N(TLR4正常)与C3H/He J(TLR4点突变)小鼠72 h,用免疫组织化学法观察血管内膜组织中细胞黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及E-选择素的蛋白质表达水平,用实时荧光定量PCR和western blot方法分别检测血管组织匀浆中ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的mRNA和蛋白质表达水平,用实时荧光定量PCR和TF活性检测试剂盒分别检测血管组织匀浆中TF mRNA表达水平及其活性。结果免疫组化结果示抗β2GPⅠ抗体刺激后的C3H/He N小鼠血管内膜中ICAM-1、VCAM-1及E-selectin蛋白均表达增强。与生理盐水对照组相比,C3H/He N小鼠和C3H/He J小鼠经抗β2GPⅠ抗体刺激后,其血管组织匀浆中ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的mRNA和蛋白质表达水平均显著增加(P均<0.05);但C3H/He J小鼠的ICAM-1、VCAM-1、E-选择素的mRNA和蛋白质表达水平均明显低于C3H/He N小鼠(P均<0.05)。经抗β2GPⅠ抗体刺激的C3H/He J小鼠血管匀浆中TF mRNA表达及生物学活性明显低于C3H/He N小鼠(P<0.05)。结论 TLR4与抗β2GPⅠ抗体刺激上调小鼠动脉血管组织表达活性分子ICAM-1、VCAM-1、E-选择素及TF密切相关,其分子机制及其在抗磷脂综合征(APS)血栓形成中的病理机制有待深入研究。
- 谢娅超周红解鸿翔孔祥民何超成思于尹婧夏龙飞
- 关键词：抗磷脂综合征TOLL样受体4黏附分子
- Toll样受体4在β2GPI诱导小鼠骨髓来源树突状细胞成熟过程中的作用被引量：5
- 2014年
- 目的探讨Toll样受体4(TLR4)在β2糖蛋白I(β2GPI)诱导小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)成熟过程中的作用。方法体外联合使用重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)诱导TLR4正常(C3H/HeN)及TLR4缺陷(C3H/HeJ)小鼠的骨髓细胞为未成熟树突状细胞(iDC)。用β2GPI或LPS(阳性对照)对iDC进一步刺激后,采用倒置显微镜观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表面分子变化,ELISA测定细胞因子IL-12和TNF-α的分泌水平。结果同C3H/HeJ小鼠相比,C3H/HeN小鼠iDC经β2GPI或LPS刺激后,细胞突起较多,形态上更成熟;细胞表面分子CD11c和MHC-Ⅱ的表达量更高(P<0.05);细胞因子IL-12和TNF-α的分泌更强(P<0.01)。结论 TLR4在β2GPI诱导小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞成熟过程中起重要作用。
- 刘敬敬周红解鸿翔胥亚张晓蕾孔祥民谢娅超何超
- 关键词：抗磷脂综合征树突状细胞TOLL样受体4
- Toll样受体4促进氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白Ⅰ/抗β2糖蛋白Ⅰ抗体复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化及活性分子的表达被引量：3
- 2014年
- 目的 观察Toll样受体（TLR）4是否参与氧化型低密度脂蛋白/β2糖蛋白L/抗β2糖蛋白Ⅰ（ox-LDL/β2 GPI/抗β2GPI）抗体复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化以及相关因子的表达,以探讨TLR4的作用.方法 分离C3 H/HeN（TLR4正常）和C3 H/HeJ（TLR4缺陷）小鼠腹腔巨噬细胞后,根据实验分组分别加入ox-LDL、ox-LDL/β2 GPI、ox-LDL/抗β2GPI、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2 GPI、脂多糖（LPS）处理48 h,油红O染色观察C3H/HeN和C3H/HeJ 2组细胞泡沫化情况；收集刺激后2组细胞总RNA及总蛋白,荧光定量聚合酶链式反应检测2组细胞组织因子（TF） mRNA水平,Western blot检测细胞核因子（NF）-κB p65的活化,酶联免疫吸附法检测细胞因子单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）表达,采用单向方差及双向方差分析组内及组间差异.结果 （1）C3H/HeN小鼠组腹腔巨噬细胞经ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激后胞质中脂滴显著增加,与C3 H/HeJ小鼠组比较差异明显.（2） ox-LDL/β2 GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导C3 H/HeN小鼠组腹腔巨噬细胞泡沫化过程中,磷酸化-NF-κB p65表达增加,与其空白对照比较差异有统计学意义（P＜0.01）,与ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的C3H/HeJ组比较,差异也有统计学意义（0.82 ±0.22比0.57±0.32,P ＜0.01）.（3）ox-LDL/β2 GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导C3H/HeN小鼠组巨噬细胞源性泡沫细胞形成时,TF mRNA及MCP-1表达明显增加,与其空白对照比较差异有统计学意义（P＜0.01）,与ox-LDL/β2 GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的C3 H/HeJ组比较,差异也有统计学意义[TF mRNA：0.041±0.023比0.005±0.003;MCP-1：（6 200.0±6.4）pg/ml比（803.3±5.5）pg/ml,P均＜0.01].结论 TLR4能够促进ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞的形成,并促进相关分子的表达及活化,提示TLR4在抗磷脂综合征相关分子诱导巨噬细胞泡沫化过程中发挥重要作用.
- 张晓蕾周红胥亚刘敬敬解鸿翔孔祥民谢娅超严金川
- 关键词：抗磷脂综合征抗原抗体复合物TOLL样受体4泡沫细胞
- β_2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用被引量：3
- 2015年
- 目的 利用人工合成β2糖蛋白1（β2GP1）多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体, 并鉴定抗体的特异性及致病性。方法 应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35~51位氨基酸的多肽, 将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）偶联, 免疫新西兰大白兔制备抗血清, 蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体, 利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性。体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞一定时间, 收集细胞总RNA和总蛋白, 实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子（TF）mRNA和蛋白表达; Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65（NF-κB p65）及磷酸化NF-κB p65表达情况; 体内实验采用C3H/HeN小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征（EAPS）模型, 检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间（APTT）。结果 化学合成β2GP1多肽的纯度为94％, 达到免疫用抗原标准。偶联KLH后免疫新西兰大白兔, 其抗血清效价大于1∶32 000。Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带, 双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合。体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、 NF-κB p65磷酸化, 诱导细胞TF mRNA及蛋白表达。体内实验成功建立EAPS小鼠模型, 小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200, APTT明显缩短。结论 所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子, 能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应。
- 解鸿翔周红孔祥民谢娅超成思于尹婧夏龙飞
- 关键词：抗磷脂综合征多肽抗原多克隆抗体
