米志强
- 作品数：102 被引量：231H指数：10
- 供职机构：军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学理学更多>>
- 利用移码突变和终止密码子提高下游目的基因的表达水平被引量：3
- 2011年
- 目的:在基因结构复杂的慢病毒载体插入报告基因并提高目的基因表达量。方法:慢病毒载体上有复杂的基因排列,为了不影响慢病毒载体的活性,必须尽量保留原有的基因,替换不必要的基因。首先将报告基因萤光素酶插入慢病毒载体替换基因Env后,结果检测不到报告基因的表达。为了提高报告基因的表达水平,将报告基因的读码框向后移动一个碱基,同时在其上游增加一个终止密码子,然后检测报告基因的表达水平。结果:通过移动报告基因的读码框同时在上游增加终止密码子,使报告基因的表达水平大大提高。结论:在构建基因表达载体时,通过改变目的基因与上游起始密码子ATG之间的相对位置以及增加终止密码子,可以大幅提高目的基因的表达水平。
- 陈斌李建彬米志强安小平李存刘大斌姜焕焕王娟黄芬张宝中范华昊何后军童贻刚
- 关键词：慢病毒载体报告基因基因表达定点突变
- 一种特异定量检测葡萄球菌的方法
- 本发明公开了一种特异定量检测葡萄球菌的方法。本发明公开的一种重组溶葡球菌酶，为如下1）或2）所示：1）SEQ？ID？No.2中自N端起第13位至第258位氨基酸所示的蛋白；2）将1）的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的...
- 童贻刚李玉元米志强安小平
- 文献传递
- shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子
- 2012年
- 构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子。方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞。结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子。结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段。
- 李建彬米志强安小平谭莉陈斌王晓娜范华昊张文慧张博方祥童贻刚
- 关键词：慢病毒载体
- 人免疫缺陷病毒假病毒药物筛选模型的构建及其应用被引量：1
- 2012年
- 目的:构建人免疫缺陷病毒(HIV)假病毒模型,用多种HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该模型,以检测其是否能有效用于HIV抑制药物的筛选。方法:通过载体改造获得最终慢病毒载体puc18-NL4-3-LUC-stop,其中含有萤光素酶基因,将该载体与包膜质粒VSV-G共转染293FT细胞,包装产生HIV假病毒,在假病毒包装和病毒感染293FT细胞的过程中加入蛋白酶和逆转录酶抑制剂,通过检测感染细胞中萤光素酶的表达来检测该模型的有效性,并利用此模型检测药物的抗病毒效果。结果:将HIV逆转录酶和蛋白酶抑制剂作用于该假病毒模型时发现萤光素酶的表达得到很大程度的抑制。结论:建立了HIV假病毒药物筛选模型,该模型以萤光素酶基因作为报告基因,快速灵敏,在抗HIV药物筛选中有一定的应用价值。
- 李建彬陈斌米志强安小平李存刘大斌王晓娜范华昊方祥童贻刚
- 关键词：人免疫缺陷病毒慢病毒载体假病毒药物筛选
- 新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达
- 王兴龙金宁一丁壮金扩世米志强李太元吕杰殷震
- 结核分枝杆菌16-kDa α晶体蛋白的原核表达及纯化
- 2012年
- 目的:利用基因工程技术原核表达并纯化结核分枝杆菌α晶体蛋白(Acr)。方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增Acr的编码基因,以pCold为载体构建重组质粒,再转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析和纯化该表达产物。结果:构建了具有正确基因序列的Acr重组表达质粒,重组Acr在大肠杆菌BL21(DE3)中经低温诱导得到可溶性表达;分别用6×His的单克隆抗体和16-kDa单克隆抗体对表达产物进行Western印迹分析,结果显示在相对分子质量约19 000处均有特异性条带,与预计大小吻合;纯化后蛋白纯度达90%,浓度达0.8 mg/mL。结论:表达了重组可溶性Acr,为深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。
- 王晓娜刘大斌安小平李存李建彬范华昊张文慧张博米志强童贻刚
- 关键词：结核分枝杆菌原核表达纯化
- 新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达
- 含有新城疫病毒(四平株)F基因的重组质粒pKSF用限制性核酸内切酶BamHⅠ和Xba Ⅰ双酶切,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,用DEAE纤维素纸回收1.76kb的F基因。用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切pFastBac Ⅰ质...
- 王兴龙金宁一丁壮金扩世米志强李太元吕杰殷震
- 文献传递
- 基于核酶自剪切机制稳定分泌丙型肝炎病毒的细胞模型
- 2010年
- 目的 利用核酶自剪切机制建立稳定分泌HCV的细胞膜型.方法 以HCV感染性克隆的全基因组cDNA重组质粒为基础,在基因组两侧引入核酶序列,构建重组质粒pJFH1-核酶,并转染入HepG2细胞,加入G418溶液筛选整合有该质粒的细胞克隆.用荧光定量PCR、免疫荧光、Westrn blot、透射电镜等技术挑选稳定分泌HCV的单细胞克隆.结果 成功筛选到稳定分泌HCV的单细胞克隆,该细胞克隆能够有效产生HCV相关蛋白,上清液中HCV滴度达到1×107拷贝/ml,电子显微镜观察HCV直径为55 nm,上清液中病毒滴度随干扰素α浓度的升高而降低. 结论 利用核酶自剪切机制可建立稳定分泌HCV的细胞模型,该模型可用于抗HCV药物的筛选.
- 王盛安小平米志强刘大斌张宝中闾军周育森童贻刚
- 关键词：基因转染
- 鸡新城疫病毒HN基因亚单位疫苗诱导免疫保护的实验研究被引量：22
- 2002年
- 实验分别将应用Ｂａｃ ｔｏ Ｂａｃ系统表达的新城疫病毒四平株和长春株血凝素－神经氨酸酶基因（ＨＮ基因）蛋白的重组杆状病毒感染Ｓｆ－９昆虫细胞后，２８ ℃培养７２ ｈ后，洗涤、收集昆虫细胞，离心浓缩，－２０ ℃冻融３次。用ＨＡ－ＨＩ实验和ＨＮ单抗中和试验测定表达产物的活性。将表达的重组蛋白作为亚单位疫苗免疫鸡。用间接ＥＬＩＳＡ和ＨＩ试验测定鸡体内抗体效价。免疫后第１５ ｄ用国家标准强毒ＮＤＶ Ｆ４８Ｅ８攻毒，统计免疫保护率。结果表明，表达的ＮＤＶ ＨＮ重组蛋白能够诱导鸡体产生抗ＮＤＶ 特异性ＩｇＧ抗体和ＨＩ抗体。实验Ⅰ组（四平株）雏鸡保护率为６５％，实验Ⅱ组（长春株）雏鸡保护率为１００％。
- 丁壮金宁一王兴龙米志强夏志平王承宇
- 关键词：新城疫病毒亚单位疫苗免疫保护率
- 新城疫病毒F基因在新型杆状病毒表达系统中的表达及重组病毒的免疫原性被引量：20
- 2001年
- 将新城疫病毒 (四平株 ) F基因插入到 p Fast Bac 质粒中 ,构建了重组质粒 p FF。 p FF转化大肠杆菌 DH10 Bac后 ,F基因在助手质粒 (helper plasmid)提供转座酶的情况下 ,通过转座进入 Bacmid,构建了重组 Bacmid(re- Bacmid)。在含有 X- gal/ IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上 ,筛选白色菌落后 ,提取 re- Bacm id转染 Sf- 9昆虫细胞。在昆虫细胞内 ,re- Bacm id经复制、表达、装配 ,形成重组杆状病毒 ,并表达 F蛋白。经 SDS- PAGE和 Western- blot分析 ,表达的 F蛋白的分子大小为 6 30 0 0 ,并证明在昆虫细胞内表达的蛋白能部分糖基化。表达的 F蛋白约占细胞总蛋白的 10 %。动物试验证明 。
- 王兴龙金宁一丁壮金扩世米志强王宏伟郭志儒殷震
- 关键词：新城疫病毒F基因杆状病毒重组病毒免疫原性
