郭敏
- 作品数：11 被引量：21H指数：3
- 供职机构：兰州生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划甘肃省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学农业科学更多>>
- 戊型肝炎病毒多拷贝分泌表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达被引量：1
- 2015年
- 目的:将胞内表达载体p AO815改建成分泌型表达载体,并体外构建戊型肝炎病毒ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,进一步比较不同转化子在毕赤酵母中的表达水平,以得到高表达重组菌株。方法:利用重叠PCR技术将α-factor信号肽基因与目的基因ORF2128-660拼接后插入去磷酸化的p AO815载体,得到分泌型表达重组质粒α-ORF2128-660/p AO815(单拷贝),然后将Bam HⅠ和BglⅡ双酶切获得的目的基因表达盒(AOX-α-ORF2128-660)插入到去磷酸化的重组质粒α-ORF2128-660/p AO815中,得到2(AOX-α-ORF2128-660)/p AO815(2拷贝),电转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导,SDS-PAGE分析不同拷贝数转化子的表达产量,ELISA检测表达产物的生物活性。结果:α-factor信号肽基因与目的基因ORF2128-660已克隆入表达载体中,目的蛋白分泌至诱导液上清中,相对分子质量约为59 000,与阴性对照比,单拷贝、2拷贝转化子表达的产物均有生物活性但表达水平无区别。结论:成功改建成分泌型表达载体,构建了多拷贝重组表达质粒,并且成功表达了目的蛋白,为利用改造的p AO815载体表达其他蛋白奠定了基础。
- 郭敏雷清刘晓蒋琳
- 关键词：戊型肝炎病毒重叠PCR毕赤酵母
- 鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定被引量：5
- 2008年
- 目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。
- 李萍蒋琳马亚茹鱼轲郭敏陆俭
- 关键词：肿瘤坏死因子-Α单克隆抗体中和活性
- 牛源材料中BVDV检测方法的验证及应用被引量：2
- 2016年
- 目的对生物制品生产过程中使用的牛源材料(牛血清、牛源细胞等)进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)检测以保证制品的生物安全性。方法参照制药质量体系Q10(ICH Q10)对杂质的定性检测要求,采用一步法RT-PCR检测BVDV的5'-UTR保守区,并对其特异性、敏感性和重复性进行验证,然后将其应用于牛源材料中BVDV的检测。结果扩增产物为250 bp的目的片段,测序后经序列比对分析软件BLAST比对,同源性达99%,且与其他5种牛源病毒均无相关性;敏感度达1CCID50/m L。应用该方法对牛血清、牛鼻甲骨细胞(BT)、牛肾原代细胞、MDBK细胞等样品进行检测,15份为阳性,阳性检出率为12%。结论一步法RT-PCR检测BVDV,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于牛源材料中BVDV的快速检测。
- 郭敏鱼轲刘军刘艳魏至栋
- 关键词：生物制品牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR
- 人巨细胞病毒糖蛋白gB基因重组腺病毒载体的构建及包装被引量：3
- 2008年
- 目的构建携带有人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白gB基因的重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中进行包装。方法将gB基因克隆至穿梭质粒Track-CMV,构建重组质粒Track-CMV/gB,亚克隆至转移载体pAD-Easy-1,构建重组质粒pAD-Easy-1/gB,将该重组骨架质粒转染HEK293细胞,利用HEK293细胞产生重组腺病毒。空斑法及PCR法挑选重组病毒,荧光显微镜观察标志蛋白(绿色荧光蛋白)的表达,利用噬斑法检测病毒滴度。结果重组腺病毒载体经酶切鉴定证明构建正确,转染重组腺病毒载体的HEK293细胞经PCR扩增,可见约700bp的目的基因片段,荧光显微镜观察可见绿色荧光蛋白表达,空斑试验检测病毒滴度为2×106PFU/ml。结论已成功构建了含有gB基因的重组腺病毒载体,为进一步研制重组腺病毒载体HCMV疫苗提供了条件。
- 马超陈勇巩莉郭敏李萍蒋琳
- 关键词：人巨细胞病毒腺病毒载体
- 戊型肝炎病毒多拷贝重组质粒的构建及在毕赤酵母中的表达被引量：2
- 2014年
- 目的体外构建戊型肝炎病毒(HEV)ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,以提高HEVORF2128-660在毕赤酵母中的表达水平。方法采用PCR技术扩增目的基因ORF2128-660(E),然后将ORF2128-660(E)同义点突变为ORF2128-660,构建重组表达质粒ORF212 8-660/p AO815(单拷贝),Bam HⅠ和BglⅡ双酶切获得的目的基因表达盒(AOX-ORF2128-660)插入去磷酸化的质粒ORF2128-660/p AO815,得到2(AOX-ORF2128-660)/p AO815(2拷贝)质粒。重复上述方法依次构建3(AOX-ORF2128-660)/p AO815(3拷贝)、4(AOX-ORF2128-660)/p AO815(4拷贝)等多拷贝重组质粒。得到的多拷贝重组质粒电转化毕赤酵母菌GS115,甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析比较不同拷贝数转化子的表达产量,ELISA检测表达产物的生物活性。结果构建了戊型肝炎病毒(HEV)ORF2128-660多拷贝重组表达质粒,表达的目的蛋白相对分子质量约为59 000,4拷贝重组质粒表达水平高于其他拷贝数重组质粒表达水平。结论成功构建了HEVORF2128-660多拷贝表达质粒,提高了其在毕赤酵母中的表达水平。
- 郭敏雷清刘晓蒋琳
- 关键词：戊型肝炎病毒毕赤酵母
- 人巨细胞病毒糖蛋白gB基因重组腺病毒载体的构建及包装
- 目的：构建携带有人巨细胞病毒糖蛋白gB基因的重组腺病毒载体，利用重组腺病毒表达功能蛋白，产生类病毒颗粒。
方法：首先将gB克隆至穿梭质粒Track-CMV构建重组质粒，再次克隆至转移载体pAD-Easy-1，构...
- 马超陈勇巩俐郭敏李萍蒋琳
- 关键词：人巨细胞病毒糖蛋白GB基因腺病毒载体基因克隆
- 文献传递
- 抗乙型肝炎表面抗原单链抗体(ScFv)的原核表达、纯化及鉴定
- 2008年
- 从抗HBsAg鼠单抗的杂交瘤细胞提取RNA,经反转录得到cDNA,进一步扩增得到鼠重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),按VH-linker-VL的结构将VH、VL基因拼接成单链抗体(scFv)基因;经测序正确后进一步构建了表达重组体p26HBSc并在E.coli中表达,得到一约30kD的外源蛋白;纯化后经ELISA检测与HBsAg有较高的亲和力活性,为下一步的人源化改造奠定了基础。
- 雷清刘鹏郭敏蒋琳
- 关键词：单链抗体连接肽
- PfS25多拷贝表达质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达
- 目的:构建Pfs25基因的多拷贝分泌表达菌株,提高Pfs25蛋白的表达水平。方法:PCR扩增分泌信号肽α因子基因与Pfs25基因的融合基因(简称αPfs25),αPfs25融合基因与胞内表达载体pAO815连接,构建Pf...
- 刘晓雷清郭敏陈勇蒋琳
- 关键词：多拷贝毕赤酵母分泌表达
- 文献传递
- 恶性疟原虫pfs25多拷贝基因在毕赤酵母中的表达分析被引量：4
- 2012年
- 目的:对恶性疟原虫pfs25的多拷贝基因重组菌株在毕赤酵母中进行表达分析,研究基因拷贝数对Pfs25蛋白表达量的影响。方法:构建重组质粒pAO815-αpfs25,利用BglⅡ-BamHⅠ同尾酶的特点,将基因表达框AOX1-αpfs25-AOX1(TT)插入到单拷贝表达质粒,依次重复,构建多拷贝重组质粒pAO815-(αpfs25)n,线性化后电转化毕赤酵母GS115,用MD平板筛选并进行表达分析。结果:构建得到1、2、3、4、5、6、7、8、10、12和14个pfs25基因拷贝的重组菌株,8拷贝pfs25基因的重组菌株表达量最高。结论:成功得到了pfs25基因的多拷贝表达重组菌株,经分析,多拷贝pfs25基因的目的蛋白表达量与其拷贝数并不呈线性正相关。
- 雷清陈勇刘晓郭敏蒋琳
- 关键词：PLASMODIUMFALCIPARUM多拷贝毕赤酵母
- 影响轮状病毒半数细胞感染剂量法滴定的因素分析被引量：1
- 2012年
- 目的:确定影响轮状病毒感染增殖过程的因素,以提高滴度检测结果的重复性和可靠性。方法:采用半数细胞感染剂量法(CCID50)结合ELISA(CCID50-ELISA)判断病毒在细胞上有无复制来检测病毒滴度。结果:不同细胞代次、接种浓度、培养时间、培养液种类和接种细胞孔数均会对病毒滴定结果造成显著影响。结论:轮状病毒滴度检测的线性和准确性与细胞状态与培养环境相关。CCID50-ELISA法检测轮状病毒滴度有良好的重复性和耐用性。
- 鱼轲魏至栋郭敏刘艳谢澎庞兴崔焰
- 关键词：轮状病毒滴度
