原代肝实质细胞被广泛应用到药物代谢和毒性评估中,但其体外培养呈现去分化状态,表现为逐渐失去正常形态和代谢解毒功能,到目前为止对去分化的分子机制并不清楚。在肝实质细胞体外去分化过程中转录因子(Transcription factor,TF)起重要作用,而且非实质细胞可以在体外维持肝实质细胞功能。然而目前的技术手段不能有效地鉴定和定量分析大量TFs。本文建立了单层肝实质细胞单独培养以及肝实质细胞与非实质细胞共培养系统,细胞培养到24、48、72 h。利用TF富集技术(Transcription factor response elements on tip,TOT)和质谱技术研究在肝实质细胞体外培养过程中TFs变化。本研究3次重复实验共鉴定到219个TFs,分析发现肝实质细胞培养过程中与细胞增殖、死亡、免疫等通路相关的TFs表达增高,而与代谢通路相关的TFs表达减弱。我们建立的肝细胞培养-TFs鉴定系统对揭示肝实质细胞去分化的分子机制以及肝实质与非实质细胞间相互作用具有重要意义。
目的:建立由于油酸大量摄入造成的HepG2细胞脂肪变性模型;发现HepG2细胞发生脂肪变性前、后转录因子DNA结合活性的差异。方法:将HepG2细胞在含2mmol/L油酸的培养基中培养24h,通过油红O染色鉴定细胞中的甘油三酯含量,并确定发生脂肪变性的程度。分别提取对照组和实验组的核蛋白,利用转录因子富集技术cat TFRE(a concatenated tandem array of the consensus transcription factor response element),同时运用深度覆盖的蛋白质组学手段,对HepG2细胞脂肪变性前、后的转录因子变化进行动态描绘和定量分析。最后,利用IPA(integrated pathway analysis)对DNA结合活性发生改变的转录因子进行功能分析。结果:对照组总共鉴定到170种转录因子,实验组总共鉴定到190种转录因子,两组总共鉴定到208种转录因子。HepG2细胞发生脂肪变性后,DNA结合活性发生变化的转录因子有101种(重复实验间差异小于2倍,不同处理间差异大于2倍),DNA结合活性加强的有67种,减弱的有34种。其中,调节糖代谢、脂代谢的关键转录因子MLX、MLXIPL的DNA结合活性减弱;NF-κB1的DNA结合活性增加,暗示了NF-κB介导的炎症反应的激活。IPA分析的结果表明,油酸激活了HepG2细胞内NRF2介导的氧化应激反应,促进了基因表达(gene expression)、细胞增殖(cell proliferation)、细胞分化(differentiation of cell)、细胞周期(cell cycle)及细胞存活(cell survival)的进程。结论:油酸诱导HepG2细胞脂肪变性会引起细胞内糖、脂代谢的紊乱,诱发炎症反应,并引起氧化损伤,但是在转录水平上,细胞通过加强脂类代谢基因的表达、减少糖类向脂肪酸的转化、促进细胞增殖及激活NRF2介导的氧化应激反应等,最终促进了HepG2细胞的存活。
