卢捷
- 作品数：5 被引量：8H指数：1
- 供职机构：中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学更多>>
- 头状链轮丝菌染色体复制起始区的克隆和对变铅青链霉菌的转化被引量：1
- 2002年
- 头状链轮丝菌 (Streptoverticillumcaespitosus)ATCC2 742 2是抗肿瘤药物———丝裂霉素A的产生菌 ,根据高GC含量革兰氏阳性菌染色体复制起始区两端基因序列的保守性 ,采用PCR方法从该菌中克隆了一段包含染色体复制起始区 (oriC)的 1 3kb片段。序列分析发现 ,克隆片段与天蓝色链霉菌的oriC及邻近区域的同源性达 80 %以上 ;头状链轮丝菌oriC中含有 2 2个DnaA box ,保守序列为TTGTCCACA。以克隆片段构建的质粒可以跨属转化变铅青链霉菌 (S .lividans)ZX7,原生质体转化效率为 3 2× 10 2 个 μgDNA ;质粒在S .lividansZX7中能以低拷贝形式稳定存在 ;转化子的菌落和菌丝形态均正常。头状链轮丝菌oriC序列与几种链霉菌的oriC有较高的同源性 ,以及在变铅青链霉菌中仍具有复制起始活性等说明链轮丝菌属与链霉菌属在系统发生上关系较近 ;但采用最大似然法分析oriC序列构建的头状链轮丝菌与几种链霉菌的系统进化树表明 ,头状链轮丝菌与几种链霉菌之间的分化距离远大于链霉菌之间的分化距离。
- 马伟茅翔卢捷姜卫红焦瑞身覃重军赵国屏
- 关键词：染色体复制起始区克隆变铅青链霉菌
- 力复霉素产生菌地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆及表达被引量：1
- 2003年
- 丙氨酸脱氢酶 (EC 1 4 1 1 )可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸和NADH。它是生物体内的氨基酸代谢和氨同化途径的关键酶。在地中海拟无枝菌酸菌 (Amycolatopsismediterranei)U32中 ,丙氨酸脱氢酶的活力与力复霉素的生物合成有负相关现象 ,其活力受KNO3全局效应的调控。根据结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis)和天蓝链霉菌 (Streptomycescoelicolor)的丙氨酸脱氢酶氨基酸的保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好 ,设计一对简并PCR引物。以此引物从地中海拟无枝菌酸菌U32中扩增到一 5 5 5bp的片段 ,并以此片段为探针从地中海拟无枝菌酸菌U32基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因 (ald)。它编码了一个 371个氨基酸的蛋白质 ,基因的GC含量为 72 5 % ,符合链霉菌的基因结构特征。在起始密码子的上游 6个碱基处 ,有一典型的链霉菌核糖体结合位点(RBS) :AGGAGG ,第 75位的氨基酸为赖氨酸 ,是丙酮酸结合位点。以pET2 8b为载体 ,在E .coliBL2 1 (DE3)中高效表达了ald基因。用IPTG在 2 2℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶活力最高。用His Tag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶。酶学性质研究表明该酶专一性以L Ala和NAD(H)
- 姚玉峰卢捷俞浩赵国屏姜卫红焦瑞身
- 关键词：地中海拟无枝菌酸菌丙氨酸脱氢酶克隆基因
- 地中海拟无枝菌酸菌U32中生物素羧基载体蛋白结构基因的克隆、表达及转录被引量：5
- 2003年
- 乙酰辅酶A羧化酶 (AcetylCoACarboxylaseEC 6.4.1 .2 ,ACC)催化依赖于ATP的乙酰辅酶A羧化形成丙二酸单酰辅酶A ,该反应是脂肪酸生物合成途径中的第一步 ,也是受到调控的关键一步。根据结核分枝杆菌 (M .tuberculosis)和天蓝色链霉菌 (S .coelicolor)中ACC -α亚基的氨基酸保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好 ,设计简并引物以U32基因组DNA为模板扩增出一条约 2 5 0bp的片段 ,并以此片段作探针成功地从U32基因组cosmid文库中克隆到相应的ACC -α亚基的编码基因accA。该基因对应的ORF长1 797bp,编码一个 5 98个氨基酸的蛋白 ,推算出的分子量是 63,71 4Da ;基因G +Cmol%含量为70 .1 % ,符合U32基因结构特征 ,距起始密码子GTG上游 6个碱基处有链霉菌典型的RBS序列AGGAGG ,并有生物素羧化酶特征的ATP结合区。利用pET2 8(b)系统构建表达载体 ,在E .coliBL2 1 (DE3)中实现了accA的诱导表达 ,产物大部分以可溶形式存在 ,并通过WesternBlot证明该蛋白上确有共价结合的生物素。NorthernBlot分析了各种氮源对accA基因转录水平的不同影响。
- 卢捷姚玉峰姜卫红焦瑞身
- 关键词：地中海拟无枝菌酸菌U32结构基因克隆转录
