曹伟伟
- 作品数：9 被引量：29H指数：3
- 供职机构：西北农林科技大学动物科技学院更多>>
- 发文基金：陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项国家教育部博士点基金陕西省科技攻关计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用被引量：5
- 2011年
- 根据猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的基因序列,分别选取各自的保守区段设计引物,通过反应条件的优化,建立了检测PPV、PRV和PCV-2的多重PCR方法。用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行检测,从对临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果看,PCV-2在正常猪群中有一定比例的存在,同时在个别猪场也存在PRV和PCV-2双重感染的现象;从临床患病猪病料中检测发现,PRV和PCV-2混合感染较严重,并有PPV+PRV+PCV-2三重感染发生;多重PCR检测结果与单项PCR检测结果的符合率达99%以上,说明建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测,为疾病诊断提供参考。
- 孙黎郭抗抗王静刘伟曹伟伟吕其壮张彦明
- 关键词：猪细小病毒伪狂犬病病毒猪圆环病毒2型多重PCR
- 检测猪分子伴侣Jiv基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立被引量：1
- 2013年
- Jiv蛋白是一种与猪瘟病毒（CSFV）复制密切相关的细胞分子伴侣，为检测CSFV感染细胞内分子伴侣Jiv基因表达变化，本研究以猪Jiv基因（DNAJCl4）为参考序列，建立了检测猪分子伴侣JiV基因的SYBRGreenI荧光定量RT．PCR方法。结果显示，所建方法的标准曲线相关系数为0．999，扩增效率为103．4％，在10‘～10’拷贝数范围内具有较好的线性关系；对Jiv基N最低可检测到10拷贝，该方法的批内变异系数和批间变异系数均在O．5％以下，具有较高的敏感性和重复性。应用建立的方法对猪多种组织及猪源传代细胞中Jiv基N的表达进行检测，结果显示Jiv基因在所检测的组织和细胞中均有表达，表明所建方法可以用于Jiv基因的检测；同时对CSFV感染猪和阴性猪脾脏中的Jiv基因表达水平进行检测，统计发现CSFV感染猪脾脏中的Jiv基因表达水平显著上调，提示Jiv基因的表达在CSFV复制中发挥着一定的作用。本研究建立的检测猪Jiv基因的荧光定量RT．PCR方法为进一步明确Jiv蛋白在CSFV致病中的作用提供方法支持。
- 谭学超郭抗抗宁蓬勃刘伟曹伟伟徐磊武宁林青
- 关键词：猪瘟病毒荧光定量RT-PCRSYBR
- 猪A组轮状病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立被引量：8
- 2012年
- 本试验旨在建立一种检测猪A组轮状病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参考GenBank上登录的猪轮状病毒OSU株的VP6基因序列保守区设计一对特异性引物,通过RT-PCR方法克隆目的基因,并将其连入pMD 19-T Vector,制备阳性标准品,优化反应条件。建立的方法在1.0×102～1.0×109拷贝/μL范围内线性关系良好,反应扩增效率大于90%,扩增相关系数大于0.98。对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒及猪圆环病毒2型均检测不到荧光信号,表明该方法特异性强。该方法批内和批间变异系数均小于2%,重复性好。结果表明,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法可为A组猪轮状病毒早期感染的诊断及病毒定量分析提供技术支持。
- 高婉俊王静林鸷曹伟伟张彦明
- 关键词：A组轮状病毒SYBR实时荧光定量PCR
- 生鲜牛奶中牛分支杆菌PCR检测方法的建立被引量：2
- 2013年
- 为建立生鲜牛奶中牛分支杆菌的PCR检测方法,选择牛分支杆菌pncA的基因序列中一段大小为423bp的片段作为靶序列,设计并合成一对引物,对所建立的PCR方法进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,建立的PCR方法在牛分支杆菌污染模型乳中成功扩增出了423bp的特异性目的条带,而分别添加有沙门菌、大肠埃希菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、嗜肺巴氏杆菌、铜绿假单胞菌及枯草杆菌的乳样中均未扩增出任何条带。牛分支杆菌的DNA最低检测限为12.18pg/μL,牛分支杆菌污染牛奶模型的敏感性为3cfu/mL。建立的方法可用于牛奶中牛分支杆菌的检测。
- 程亮宁蓬勃张彦明曹伟伟刘伟战仁武
- 关键词：牛分支杆菌聚合酶链反应生鲜牛奶
- 猪圆环病毒1型和2型a与b基因型三重PCR鉴别方法的建立及应用被引量：3
- 2013年
- 根据PCV-1、PCV-2a和PCV-2b差异序列,设计了3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了可以用于PCV检测及PCV-1、PCV-2a和PCV-2b分型的PCR方法。结果表明,三重PCR检测的最低敏感度可达4.87×107 copies/μL(PCV-1)、2.83×107 copies/μL(PCV-2a)和2.96×106 copies/μL(PCV-2b)。引物特异性良好,各引物之间没有交叉反应,对伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)检测均为阴性。应用该方法对采自陕西省的56份样品进行检测,PCV-1检出率57.14%(32/56),PCV-2a检出率1.78%(1/56),PCV-2b检出率42.86%(24/56),多重PCR检测结果与单PCR检测结果的符合率达99%以上,可用于猪圆环病毒的临床检测及流行病学监测等。
- 徐磊郭抗抗陈恒曹伟伟吕其壮宁蓬勃张彦明
- 关键词：猪圆环病毒1型三重PCR
- 猪瘟病毒实时定量PCR检测方法的建立及初步应用被引量：2
- 2012年
- 为建立一种快速检测猪瘟病毒的基因检测方法,根据GenBank中猪瘟病毒(CSFV)基因组NS2基因序列设计并合成引物和Taq Man探针,通过各项条件优化并以10倍稀释度的质粒为标准品进行实时定量PCR扩增制作标准曲线,建立检测CSFV的实时定量PCR方法。该方法的检测灵敏度可达每微升10个拷贝,比常规PCR方法的灵敏度高出1个数量级;对标准品质粒检测的线性范围是1.0×109～1.0×101μL-1。对1.0×107、1.0×105、1.0×103μL-13种稀释度的标准品质粒进行重复试验,批内变异系数分别是0.30%、0.85%、0.43%,批间变异系数分别是0.81%、1.36%、0.63%,具有良好的重复性。应用该方法对45份临床样品进行检测,检出26份阳性样品,而常规PCR只检测出19份阳性样品,说明该实时定量PCR方法的敏感性高于常规PCR。可见,该方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可用于检测病料中的猪瘟病毒。
- 程敏郭抗抗张彦明何雷董玲娟李维维刘伟曹伟伟张渭东
- 关键词：猪瘟病毒实时定量PCRTAQ
- 抗猪瘟病毒转基因猪的研究
- 为研究获得抗猪瘟病毒转基因猪，本研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段，获得4个重组慢病毒，分别感染PK-15细胞，筛选获得阳性细胞，扩大培养后猪瘟病毒，在接毒后72h对病毒进行检测，比较其对猪瘟病毒的干扰效...
- 郭抗抗曹伟伟程敏张彦明雷安民宁蓬勃何雷董玲娟谭学超徐磊
- 关键词：转基因猪慢病毒
- 文献传递
- 猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用被引量：8
- 2013年
- 【目的】建立一种能在临床上快速、准确检测猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)的TaqMan实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中已公布的PCV-2陕西分离株的全基因序列,在PCV-2的ORF2核苷酸序列的保守区域,设计合成1条TaqMan探针和1对特异性引物;利用设计的引物扩增ORF2部分基因并鉴定后,回收PCR扩增产物,连接pMD19-T载体,转化DH5α大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR及测序鉴定后提取质粒,作为荧光定量PCR的标准品;以标准品为模板建立检测PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法,并对该方法的灵敏度、稳定性和特异性进行评价;用建立的荧光定量方法对56份临床样品进行检测,并将检测结果与传统PCR方法进行比较。【结果】建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,其标准曲线的斜率为-3.383,R2=0.998,具有良好的线性关系;重复性试验结果表明,该方法循环数阈值Ct的变异系数(CV)为0.86%～1.02%,具有良好的稳定性;敏感性检测结果表明,该方法的最低检测限度为5.06copies/μL;特异性检测结果显示,该方法对猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测结果均为阴性,对PCV-2标准品的检测结果为阳性,说明该方法具有较好的特异性。临床样品的检测中,所建立的Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法的检出阳性率较传统PCR方法高14.3%。【结论】成功建立了PCV-2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,该方法可用于临床上对PCV-2的检测。
- 曹伟伟郭抗抗许信刚宁蓬勃刘伟程敏董玲娟徐磊高婉俊任敏
- 关键词：病毒检测
- 转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立及抗猪瘟病毒转基因猪的构建
- 2013年
- 【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段(P2)的转基因猪。
- 郭抗抗雷安民宁蓬勃程敏何雷刘伟谭学超徐磊曹伟伟张彦明
- 关键词：猪瘟病毒慢病毒转基因猪
