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李晓敏: 作品数：23 被引量：95H指数：5; 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金江苏高校优势学科建设工程资助项目高等学校学科创新引智计划更多>>; 相关领域：轻工技术与工程化学工程生物学农业科学更多>>

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胃乙醇脱氢酶δδ-ADH的原核表达及酶学性质被引量：1: 2019年; 为获得人胃乙醇脱氢酶δδ-ADH,根据GeneBank中δδ-ADH的基因序列合成目的基因ADH7,构建重组表达载体pET-32a(+)-ADH7,并转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。获得的阳性转化子经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,目的蛋白质以包涵体的形式得到大量表达。用1 mol/L尿素溶解包涵体获得有活性的粗酶液,经HisTrapTM excel亲和层析柱纯化获得目的蛋白质,检测δδ-ADH酶活并对其基本酶学性质进行研究。结果显示,δδ-ADH的活性为2.085 U/mg,Km为28.43 mmol/L,Vmax为316.46μmol/(L·min)。δδ-ADH的最适反应温度为40℃,在30~50℃范围内温浴60 min,相对酶活在47%以上;最适pH为9.0,将δδ-ADH在不同pH(pH 3.0~11.0)的广泛缓冲液中于25℃保温30 min,在pH 6.0~11.0范围内酶活较稳定。pH 5.0时,相对酶活剩余60%;在0、500、1 000、1 500 mmol/L乙醇中37℃温浴30 min,相对酶活分别为65.6%、51.1%、45.4%和44.4%。; 常开霞常开霞孙军勇吴殿辉李晓敏陆健; 关键词：乙醇脱氢酶基因克隆酶学性质

黄酒发酵过程中乳酸菌的分离及对其产生物胺能力的评价被引量：11: 2017年; 对黄酒酿造过程中乳酸菌进行分离,并对乳酸菌产生物胺能力进行检测。利用脱羧培养基对分离出的82株乳酸菌进行培养,结合反相高效液相色谱技术(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RPHPLC)测定发酵液中生物胺含量,具体色谱条件如下:使用丹磺酰氯(Dansyl Chloride,Dns-CL)进行柱前衍生,以乙腈-乙腈(φ=50%)为流动相梯度洗脱,流速1.0 m L/min,254 nm紫外波检测。该方法在给定浓度范围内线性关系良好(R^2>0.996),平均回收率为94.46%~105.20%,相对偏差(RSD)均小于5%。检测到组胺产生菌株11株,最大生成量为18.19 mg/L,高产菌株分离自黄酒前酵第2天;酪胺产生菌株28株,最大生成量为30.38mg/L,高产菌株分离自黄酒前酵第2天;腐胺产生菌株51株,最大生成量为299.94 mg/L,高产菌株分离自浸米水。由此表明,有必要控制黄酒发酵过程中的乳酸菌,采用低产或不产生物胺的乳酸菌作为强化菌株,可降低黄酒中的生物胺含量。; 王然然李晓敏陈柳卞小稳蔡国林陆健; 关键词：黄酒乳酸菌生物胺

黄酒发酵液中产瓜氨酸乳酸菌的分离鉴定与评价被引量：4: 2015年; 为了解黄酒发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物瓜氨酸的来源,从黄酒发酵醪液中分离得到9株乳酸菌,并通过生理生化鉴定和16S r DNA序列分析,结果表明,菌株z1为Lactobacillus plantarum,菌株z2和z3为L.hilgardii,菌株z4为L.diolivorans,菌株z5和z7为L.brevis,菌株z6和z9为L.casei,菌株z8为L.fermentum。采用平板检测法结合分子检测法对9株乳酸菌产瓜氨酸能力进行了评价,结果显示,其中6株菌均能不同程度地降解精氨酸产生瓜氨酸,且与菌株中是否存在ADI途径编码基因簇中的关键基因arc A、arc B和arc C直接相关。此外,还应用HPLC对各菌株产瓜氨酸能力进行了精确定量,发现无论是在添加了精氨酸的培养基还是在灭菌后的黄酒培养液中培养,乳酸菌在利用精氨酸的过程中不断向胞外分泌瓜氨酸,从而积累氨基甲酸乙酯。本研究结果为进一步用微生物手段控制黄酒中氨基甲酸乙酯形成提供了思路。; 李晓敏王霈虹吴殿辉孙军勇陆健; 关键词：黄酒氨基甲酸乙酯瓜氨酸乳酸菌

CRISPR/Cas9介导的低产尿素黄酒酵母工程菌的构建被引量：1: 2019年; 通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术转化酿酒酵母S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1,在敲除CAR1和过表达DUR1,2基因的基础上过表达DUR3基因,获得工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1。实验室黄酒发酵实验结果表明,与亲本菌株S.cerevisiae Na相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了92.1%,EC含量降低了58.6%;与出发菌株S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了43.4%,EC含量降低了16.2%。过表达DUR3的工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1具有“尿素吸收”的能力,减少EC的形成。借助CRISPR/Cas9系统,构建的酵母工程菌无外源抗性基因的引入,具有工业化应用的潜在可能性。; 谢文娟吴殿辉吴殿辉李晓敏谢广发李晓敏; 关键词：黄酒酿酒酵母尿素氨基甲酸乙酯

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在毕赤酵母中的表达及其对大麦麦芽过滤性能的影响被引量：4: 2018年; PCR技术从黑曲霉(Aspergillus niger)基因组扩增获得1个全长1 790 bp的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因,基因含有1个50 bp的内含子序列,其对应的蛋白质序列含有5个O糖基化位点和9个N糖基化位点,N端含有18个氨基酸的信号肽序列。将目的基因与表达载体pPICZαA连接并在毕赤酵母X-33诱导表达,获得重组α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶。重组酶的相对分子质量为70 kDa,最适反应pH和温度分别为pH 5.5和50℃;金属离子Cu^(2+)、Zn^(2+)和Fe^(2+)对重组酶的酶活有抑制作用,Fe^(3+)对重组酶的酶活有促进作用;以4-Nitrophenylα-L-arabinofuranoside为底物测得酶的Km值和Vmax值分别为0.78 mmol/L和2.57μmol/(min·mg)。在大麦麦芽协定糖化的初始阶段添加31.2 mU/g重组酶,麦汁的过滤速度提高了12.8%。以大麦麦芽阿拉伯木聚糖为底物,α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶与木聚糖酶有较好的协同作用。; 解西柱张明林材蔡国林吴殿辉吴殿辉陆健; 关键词：克隆表达麦芽

低产尿素黄酒酵母工程菌的酿造特性: 2020年; 为考察酵母工程菌在黄酒酿造过程中的发酵性能及其降低发酵液中尿素和氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的能力,以前期构建的降低黄酒中尿素和EC效果最好的酵母工程菌N85 DUR1,2-c为研究对象,利用单因素试验考察黄酒发酵工艺对其降低发酵液中尿素和EC能力的影响,并对其在生产试验过程中的发酵性能进行研究。结果表明,酵母接种量、发酵温度以及麦曲添加量等工艺参数对工程菌N85 DUR1,2-c低产尿素和EC的性能没有明显的影响,且含量低于亲本菌株。50 kL生产试验表明,工程菌N85 DUR1,2-c所酿黄酒中理化指标含量正常,符合黄酒国标的要求。而N85 DUR1,2-c发酵液中尿素和EC的含量分别为(2.4±0.2)mg/L和(14.9±0.6)μg/L,较亲本菌株分别降低了90.7%和54.6%,且贮存过程中EC含量增加缓慢。说明酵母工程菌N85 DUR1,2-c在不改变黄酒优良品质的前提下,能够显著地降低发酵液中尿素的含量,可以从根源上减少黄酒中EC的积累,提高饮用安全性。; 吴殿辉吴殿辉蔡国林李晓敏李晓敏陆健; 关键词：黄酒氨基甲酸乙酯尿素酿造特性

代谢工程改造克雷伯氏菌生产1,3-丙二醇: 2024年; 1,3-丙二醇是生产聚对苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethylene terephthalate,PTT)的重要单体,目前主要通过微生物发酵法生产,但这种方法生产效率低下,限制了1,3-丙二醇的高效生物制造。为解决这一问题,本研究首先利用常压室温等离子(atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变技术,经过高通量筛选,成功获得了一株具有较高渗透压耐受性的菌株,其1,3-丙二醇产量达87 g/L。在此基础上,进一步筛选出了适合克雷伯氏菌的基因表达元件,并通过代谢工程改造,阻断冗余代谢支路(敲除ldhA、budA、aldA基因),同时强化合成路径(过表达dhaB、yqhD基因),使得改造后的工程克雷伯氏菌的1,3-丙二醇产量提升至107 g/L。最终,在5 L发酵罐中,通过优化发酵过程参数,最优工程菌株KP-FMME-6的1,3-丙二醇产量达到118 g/L,甘油转化率为42%,生产强度达到2.46 g/(h·L)。本研究为1,3-丙二醇的工业化生产提供了有效的借鉴和参考。; 张少伦高聪李晓敏刘佳陈修来刘立明; 关键词：3-丙二醇克雷伯氏菌高通量筛选代谢工程

代谢工程改造大肠杆菌生产尸胺: 2024年; 尸胺是聚酰胺生产中的关键C5单体。由于细胞内5'-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate,PLP)再生效率有限,导致目前发酵法生产尸胺效率较低。本研究选择一株实验室保藏的赖氨酸高产大肠杆菌LY-4为研究对象,首先通过引入尸胺合成关键酶-赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,LDC),成功构建了菌株L01,摇瓶发酵尸胺产量达1.07 g/L;随后开发了一种双代谢通路强化策略,协同增强内源和异源PLP合成模块,从而改善胞内PLP的合成,最优菌株L11摇瓶生产尸胺产量提升至9.23 g/L;最后在5 L发酵罐中对菌株L11生产尸胺的发酵工艺进行优化。工程菌株经48 h分批补料发酵,尸胺产量、得率、生产强度分别为54.43 g/L、0.22 g/g和1.13 g/(L·h),具备一定的应用潜力。本研究可为构建包括尸胺在内的多种生物胺类细胞工厂提供理论依据和技术基础。; 刘存萍高聪李晓敏陈修来吴静宋伟魏婉清刘立明; 关键词：大肠杆菌代谢工程发酵优化

啤酒大麦种子蛋白质组的分级制备及初步分析被引量：1: 2014年; 大麦种子蛋白主要分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,它们在大麦种子中起到不同的作用,因此对每个组分的研究具有重要的理论和实际意义。根据4种蛋白质组分的溶解性不同,可利用分级提取的方法获得4种组分的蛋白质溶液;进而利用TCA沉淀和TCA-丙酮沉淀法对4种蛋白质进行除杂和浓缩,获得适用于双向电泳的蛋白质提取液。利用SDS-PAGE和双向电泳检测提取效果,发现所得SDS-PAGE凝胶条带清晰,双向电泳图谱分辨率高,蛋白质点清晰;经PDQuest分析,谱图结果显示检测到450个水溶蛋白质点和100个醇溶蛋白质点。大麦种子中各组分蛋白质组的分级提取方法的构建,为后续对各组分蛋白组进行质谱鉴定及功能分析奠定了基础。; 李晓敏游丽华王迎新陆健董建军余俊红尹花; 关键词：醇溶蛋白双向电泳

乙醛脱氢酶的克隆表达及其酶学性质被引量：3: 2018年; 将Gene Bank中人源乙醛脱氢酶2的基因序列根据酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的密码子偏好性进行密码子优化后合成目的基因ALDH2,采用融合PCR技术,构建人源ALDH2基因的表达组件TRP1L-URA3-TPIp-ALDH2-TPIt-TRP1R。通过电转化的方法将基因表达组件通过同源重组整合到酿酒酵母W303-1A的基因组上,获得基因工程菌W303-ALDH2。工程菌发酵后的粗酶液经His TrapTMexcel亲和层析柱纯化获得重组ALDH2,其活性为20.70 U/mg;重组酶的相对分子质量是56 k Da;最适反应pH和温度分别为5.0和35℃;除Na+外,K+、Ca2+、Mg2+、Mn2+均能不同程度地提高ALDH2的酶活。以乙醛为底物测得酶的Km值为0.908 mmol/L,最大反应速度Vmax为114.94 U/mg;以辅酶NAD+为底物测得酶的Km值为0.282 mmol/L,最大反应速度Vmax为58.82 U/mg。; 豆欣喜张明林材吴殿辉李晓敏李晓敏蔡国林孙军勇; 关键词：酿酒酵母克隆表达酶学性质

李晓敏

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