李默
- 作品数：12 被引量：19H指数：3
- 供职机构：石河子大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金博士科研启动基金国际科技合作与交流专项项目更多>>
- 相关领域：医药卫生农业科学生物学经济管理更多>>
- 羊种布鲁氏菌新疆流行株015株sodc基因缺失株的构建与初步评价被引量：6
- 2016年
- 为了构建布鲁氏菌015 sodc基因缺失株,本研究采用PCR方法以热灭活的羊种布鲁氏菌新疆流行株015为模板,分别扩增sodc基因的上下游同源臂序列;以枯草芽孢杆菌为模板,扩增Sac B基因,将扩增序列分别连至克隆载体p MD19-T simple上并测序,然后在双酶切后将上下游同源臂序列连接至自杀载体p GEM-7Zf+上,分别得到了p GEM-7zf-Δsodc,再将Sac B基因单酶切后连接至上述载体上,构建成同源重组自杀质粒pss。经8%蔗糖平板筛选鉴定Sac B基因的活性。将构建好的自杀质粒分别电转化至布鲁氏菌015感受态细胞中,通过氨苄抗性筛选和8%蔗糖敏感筛选后获得了015Δsodc基因缺失株。对获得的基因缺失株进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。通过检测侵染小鼠巨噬细胞cfu、缺失株免疫小鼠后体内Ig G,IFN-γ的水平,及脾脏cfu,对其毒力进行了初步评价。结果表明,该缺失株20代内未发生回复性突变,成功构建了具有非抗性基因标记的缺失株,并且015Δsodc细胞cfu、脾脏cfu,及IFN-γ的水平都显著低与亲本株015,说明毒力与亲本株相比有一定程度的下降。本研究可为今后布鲁氏菌致病机理及新疫苗的研究提供实验材料。
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- 关键词：布鲁氏菌
- 农业类上市公司审计风险识别与控制研究
- 农业是中国国民经济的基础产业，是人类社会稳定发展的坚实后盾。随着我国经济不断转型和升级，农业企业也越来越受到关注和重视。但农业企业受到自然环境和资源的约束，承担着较大的风险压力，技术含量较低和创新能力不足也使得产品核心竞...
- 李默
- 关键词：行政处罚审计风险识别审计风险控制财务造假
- 布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspB的原核表达及布鲁氏菌免疫逃逸分析被引量：4
- 2015年
- 目的克隆并表达布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspB并推测其免疫逃逸机制。方法以羊种布鲁氏菌16M基因组为模板,利用PCR扩增布鲁氏菌分泌蛋白BspB(BAB1-0712)基因,连接pMD19-T载体后测序,将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-30a载体中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。结果成功克隆了BspB基因,片段大小为564bp;SDS-PAGE检测,BspB蛋白分子质量单位约为27.5ku;Western blot分析显示,BspB蛋白均可被布鲁氏菌阳性血清识别。该蛋白测序后与先天性免疫分子IL-1R、MyD88、TLR-2、TLR-4、SIGIRR比对,具有一定的同源性。结论重组蛋白BspB具有免疫反应原性,可作为候选诊断抗原;由于其序列与IL-1R、MyD88、TLR-2、TLR-4及SIGIRR有一定同源性,BspB可能在布鲁氏菌感染宿主过程中发挥免疫逃逸的作用。
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- 关键词：布鲁氏菌原核表达免疫逃逸
- 布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF的原核表达及布鲁菌免疫逃逸分析
- 2016年
- 目的克隆并表达布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白BspA、BspF并推测其免疫逃逸机制。方法以羊种布鲁菌16M基因组为模板，利用PCR扩增布鲁菌分泌蛋白BspA（BAB1-0678）、BspF（BAB1-1948）基因，连接质粒pMD19-T后测序，将测序正确的基因片段经双酶切后克隆至pET-30a（＋）载体中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS—PAGE）和蛋白质免疫印迹（Western blot）分析鉴定表达产物；并与先天性免疫分子的蛋白序列进行比对分析。结果成功克隆了BspA、BspF基因，片段大小分别为576、1287bp；SDS—PAGE显示，BspA、BspF蛋白相对分子质量分别约为28×10^3、55×10^3；Western blot分析显示，BspA、BspF蛋白均可与布鲁菌阳性血清发生特异性反应，并且与先天性免疫分子白细胞介素1R（IL-1R）、髓样细胞分化因子88（MyD88）、Toll样受体2（TLR-2）、Toll样受体4（TLR-4）、单免疫球蛋白白介素1相关受体（SIGIRR）有同源性。结论成功获得了布鲁菌BspA、BspF蛋白，通过同源性分析，证明BspA、BspF蛋白在布鲁菌感染宿主过程中具有免疫逃逸的作用。研究结果为进一步研究布鲁菌的致病机制和揭示布鲁菌免疫逃逸机制提供了理论依据。
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- 关键词：蛋白质类原核表达免疫逃逸
- 抑制剂LY294002调控胞内布鲁氏菌的存活
- 2015年
- [目的]检测PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002(LY)对巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M(16M)存活的影响。[方法]将抑制剂LY(20μmol/L)与细胞共同孵育1 h,并将其腹腔注射小鼠(20 mg/kg/day),然后16M感染巨噬细胞和小鼠,细菌菌落计数法计算细胞内和小鼠体内的细菌数量,MTT法检测抑制剂LY对细胞活性的影响,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抑制剂LY对TNF-α分泌的影响。[结果]抑制剂LY在20μmol/L浓度时不影响细胞活性,抑制剂LY显著抑制了布鲁氏菌在巨噬细胞和小鼠体内的存活(P<0.05),抑制剂LY显著提高了布鲁氏菌介导的TNF-α水平(P<0.01)。[结论]研究表明,PI3K/Akt信号通路抑制剂LY可调控巨噬细胞和小鼠体内羊种布鲁氏菌16M的存活,为布鲁氏菌致病机制提供科学依据。
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- PI3K/Akt信号通路在巨噬细胞内布鲁氏菌存活中的应用
- 本发明公开了PI3K/Akt信号通路在巨噬细胞内布鲁氏菌存活中的应用，PI3K/Akt信号通路促进布鲁氏菌存活。所述布鲁氏菌包括粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308。PI3K/Akt信号通路更能促进光滑型的S2308...
- 张俊波印双红罗静李建新冉辉李默
- 文献传递
- PI3K/Akt信号通路在胞内布鲁氏菌存活中的作用
- 2016年
- 为了检测对PI3K/Akt信号通路在巨噬细胞内布鲁氏菌存活的影响,将布鲁氏菌粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308分别侵染细胞,应用Western blot技术检测RB51和S2308和对巨噬细胞内p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的影响;用MTT法检测抑制剂LY294002(LY)对细胞活性的影响;通过菌落计算法,检测抑制剂LY对胞内菌RB51和S2308存活的影响。结果表明,粗糙型菌株RB51和光滑型菌株S2308都可激活PI3K/Akt信号通路,但粗糙型菌株RB51的激活程度显著弱于光滑型菌株S2308(P<0.01);抑制剂LY在小于或等于20μmol/L浓度时不影响细胞活性;抑制剂LY(20μmol/L)可显著抑制光滑型菌株S2308的存活,但不影响粗糙型菌株RB51的存活。本研究表明,PI3K/Akt信号通路在光滑型菌株存活中发挥重要作用。
- 张俊波印双红李默冉辉罗静李建新陆安法郭飞陈创夫
- 关键词：PI3K/AKT信号通路
- 布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白DK63-887基因缺失株的构建及鉴定
- 2016年
- 为了构建羊布鲁菌16M(简称16M)的DK63-887基因缺失株(16MΔDK63-887),探讨该基因与16M介导自噬的关系。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那基因替换DK63-887基因,获得突变株16MΔDK63-887。将亲本株16M、疫苗株M5-90、突变株16MΔDK63-887在相同条件下振荡培养,观察其生长趋势变化;将各菌株置于不同外界环境中,观察其生存率;将各菌株侵染小鼠巨噬细胞,比较它们在宿主细胞内的生存能力及RT-qPCR检测自噬相关基因的表达。成功获得了布鲁菌DK63-887基因缺失株且在20代内未发生回复性突变现象。与亲本株相比,16MΔDK63-887在体外培养生长趋势与亲本株相似,只是细菌的浓度存在一定差异;突变株在外界应激条件下生存能力低于亲本株;侵染4h后缺失株胞内细菌数量明显下降;RT-qPCR检测到突变株的ULKI、Beclin1表达量均显著降低(P<0.01),结果表明,布鲁菌Ⅳ型分泌系统效应蛋白与16M介导的细胞自噬密切相关,为16M胞内寄生机制的研究奠定了基础。
- 江雅丽陈创夫李志强李默李爽王震张欢张辉郭飞
- 关键词：布鲁菌自噬相关基因
- 羊种布鲁氏杆菌16M对PI3K/Akt信号通路的激活
- 2015年
- 为了检测巨噬细胞内羊种布鲁氏杆菌16M（16M）对PI3K/Akt信号通路的激活,试验将16M侵染巨噬细胞应用Western-blot技术检测巨噬细胞内p-Akt（S473）和p-Akt（T308）表达变化,利用抑制剂LY294002对PI3K/Akt信号通路进行阻断,用MTT法检测抑制剂LY294002对细胞活性的影响。结果表明：16M在0.5-4 h可激活PI3K/Akt信号通路;抑制剂LY294002可阻断16M对PI3K/Akt信号通路的激活,且具有浓度依赖性;抑制剂LY294002在小于或等于20μmol/L浓度时不影响细胞活性。
- 张俊波印双红李默罗静冉辉李建新陆安法郭飞陈创夫
- 关键词：PI3K/AKT信号通路免疫印迹巨噬细胞
- 金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌在不同环境下存活率的比较被引量：9
- 2016年
- 目的用几种不同方法处理细菌,观察对比革兰阳性菌与革兰阴性菌存活率的差异,了解革兰阳性菌和革兰阴性菌的生理特征。方法选取金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌为代表,等比稀释后观察两组细菌A600值的变化情况及与CFU的关系;经过反复冻融、酸碱处理,计数两组细菌CFU,观察两组细菌存活率差异;使用相同浓度的溶壁酶对两组细菌细胞壁进行裂解,观察两组细菌菌体蛋白释放情况。结果等比稀释两组细菌,A600值及CFU计数并未按等比下降。在无保护剂的条件下反复冻融3次,大肠埃希菌全部死亡,金黄色葡萄球菌尚有16.14%存活。反复冻融7次后金黄色葡萄球菌全部死亡。在有保护剂的条件下反复冻融5次,大肠埃希菌全部死亡,金黄色葡萄球菌尚有22.09%存活。反复冻融13次后金黄色葡萄球菌全部死亡。在不同pH值培养条件下,金黄色葡萄球菌耐受酸碱变化的范围宽,而大肠埃希菌表现出耐酸的特点。经相同浓度溶壁酶作用后,大肠埃希菌菌体蛋白释放量多于金黄色葡萄球菌。结论金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌对反复冻融、酸碱及溶壁酶的耐受性不同,可供做细菌学实验时参考。
- 于潞杨敏李默杜新辉孟祥慧曹旭东
- 关键词：革兰阳性菌革兰阴性菌金黄色葡萄球菌大肠埃希菌存活率
