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人Tau基因多表位肽段原核表达载体的构建与表达被引量：1: 2012年; 目的构建含人Tau多表位肽段基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化目的蛋白,检测Tau多表位DNA疫苗免疫小鼠后特异性抗体产生情况。方法以质粒pVAX1-Tau为模板,用PCR扩增人Tau多表位肽段基因,插入表达载体pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-TauP1/P2。将鉴定后的阳性重组质粒转入E.coli BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并采用GST法纯化、SDS-PAGE鉴定目的蛋白的表达。以TauP1/P2 DNA疫苗免疫小鼠获取血清,Dot-blot检测TauP1/P2特异性抗体产生情况。结果 PCR扩增出约300 bp的基因片段,克隆至表达载体后,经酶切和测序验证正确;获得了纯化的目的蛋白,并证实了GST-TauP1/P2融合蛋白的表达。Dot-blot检测到特异性TauP1/P2抗体的产生。结论成功构建和表达人Tau多表位肽段基因的目的蛋白GST-TauP1/P2,能够识别Tau多表位DNA疫苗免疫后小鼠产生的特异性TauP1/P2抗体。; 孙海涛杨化强杨璐军李正阳杜谋选陈宇新姜晓丹; 关键词：TAU 质粒原核表达融合蛋白

人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞分化的影响被引量：6: 2018年; 背景:神经干细胞来源非常有限,而且在自然分化过程中绝大多数分化为神经胶质细胞,分化为神经元的比例相对较少,因此采取有效措施诱导其向合适的子细胞方向分化是非常重要的科研课题。以往研究证明人参皂苷类成分,如Rb1和Rg1,对神经干细胞的定向分化有一定影响,但Rg3是否对神经干细胞的分化起作用鲜有报道。目的:研究人参皂苷Rg3对小鼠神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的影响。方法:分离孕14 d的C57BL/6小鼠的胎鼠大脑皮质神经干细胞并传代培养,用神经干细胞特异性免疫抗体Nestin和Sox2检测神经干细胞纯度。用分化培养基联合人参皂苷Rg3(空白对照、50 nmol/L和250 nmol/L)诱导神经干细胞分化3 d,然后用神经元特异性免疫抗体Tuj1和星形胶质细胞特异性免疫抗体GFAP检测神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞的情况,计算Tuj1^+/DAPI和GFAP^+/DAPI的比例;通过实时荧光定量PCR技术检测各组细胞Tuj1和GFAP mRNA的表达水平。结果与结论:(1)经细胞免疫荧光实验检测传代培养的小鼠胎鼠细胞几乎全为Nestin和Sox2双阳性细胞,表明成功分离培养出纯度较高的神经干细胞,可以用于后期实验;(2)诱导分化3 d后,与空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组相比,50 nmol/L人参皂苷Rg3组对神经干细胞分化为神经元具有明显促进作用(P<0.01),而空白对照组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异无显著性意义(P>0.05);(3)诱导分化3 d后,与空白对照组相比,50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组对神经干细胞分化为星形胶质细胞具有促进作用(P<0.05),而50 nmol/L人参皂苷Rg3组和250 nmol/L人参皂苷Rg3组之间差异不明显(P>0.05);(4)real time PCR结果总体与细胞免疫荧光结果相似;(5)结果表明,人参皂苷Rg3在50 nmol/L浓度时能明显促进神经干细胞向神经元和星形胶质细胞方向分化;但在250 nmol/L浓度时主要促进; 张凤兰杨璐军胡炜彦周姣月马生霞肖志成; 关键词：人参皂苷RG3 神经干细胞分化神经元星形胶质细胞干细胞

不同胎龄小鼠脑组织中神经干细胞所占比例的研究被引量：3: 2017年; 目的详细了解并比较不同胎龄小鼠全脑和大脑皮层组织中神经干细胞(neural stem cells,NSCs)所占比例,为后期优化分离培养NSCs提供直接量化数据。方法分离不同胎龄小鼠全脑(胎龄12.5、14、16和18d)和大脑皮层(胎龄14、16和18 d)组织,消化成单细胞悬液,贴壁培养3~4 h,细胞免疫荧光标记NSCs特异性标记物Nestin,统计分析各组中NSCs所占比例。另外,通过实时荧光定量PCR技术检测Nestin mRNA在不同胎龄(12.5、14、16和18 d)小鼠大脑皮层中的表达水平。结果细胞免疫荧光结果显示,分离培养的不同胎龄小鼠全脑和大脑皮层组织中均有Nestin阳性细胞。在分离培养的小鼠全脑组织中胎龄12.5 d组NSCs所占比例最高,为53.42%±1.57%;胎龄18 d组NSCs所占比例最低,为25.96%±1.31%,而胎龄14 d组和16 d组位于二者之间。在分离培养的不同胎龄小鼠大脑皮层组织中,胎龄14 d组NSCs所占比例最高,为33.65%±0.29%;胎龄18d组比例最低,为25.29%±0.28%,胎龄16 d组位于二者之间(26.82%±0.30%)。实时荧光定量PCR结果显示,当把胎龄12.5 d组的小鼠大脑皮层组织中Nestin mRNA表达水平设定为1,胎龄14 d组的小鼠大脑皮层组织中Nestin mRNA的相对表达量为0.83±0.04,胎龄16 d组为0.77±0.05,胎龄18 d组为0.44±0.05。因此,随着小鼠胎龄增加,小鼠大脑皮层中的Nestin mRNA的表达水平逐渐下降。结论在小鼠大脑发育过程中,随着胎龄增加,分离培养的小鼠全脑和大脑皮层组织中神经干细胞比例逐渐降低。; 张凤兰杨璐军朱红梅张南炀沙学芳朱柯颖肖志成; 关键词：小鼠不同胎龄神经干细胞全脑大脑皮层

人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞增殖的影响被引量：2: 2018年; 目的研究人参皂苷Rg3对体外培养小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响.方法分离培养胎鼠NSCs,使用神经球悬浮培养法传代,特异性抗体Nestin和Sox2鉴定NSCs.采用Brd U标记法和CCK-8法检测不同浓度Rg3(20 n M、50 n M、250 n M和500 n M)对NSCs增殖的影响.结果传代2次后的神经球几乎全为Nestin/Sox2免疫荧光双阳性细胞,表明其为纯度较高的NSCs.Brd U标记法表明与对照组、20 n M组、250 n M组和500 n M组相比,50 n MRg3组Brd U阳性细胞相对比率最高,差异有统计学意义(P<0.01),但其他各组之间差异无统计学意义(P>0.05).CCK-8法检测,结果显示50 n M Rg3在450 nm处吸光值最高,且与对照组(P<0.01)、20 n M组(P<0.05)和500 n M组相比,差异有统计学意义(P<0.01),但其他各组之间无统计学差异(P>0.05).结论人参皂苷Rg3能促进体外培养小鼠NSCs的增殖,且其最佳浓度是50 n M.; 张凤兰赵瑜袁婧杨璐军鲁琳; 关键词：神经干细胞人参皂苷RG3 增殖 BRDU CCK-8

TAG-1对U251细胞活力的影响及相关基因调节机制研究: 2010年; 目的探讨TAG-1对U251细胞的生长活力和粉样前体蛋白胞内段（AICD）,p53和表皮生长因子受体（EGFR）~因表达变化的影响。方法以MTT法检测不同浓度TAG．1（0、5、10、20μg／mL）对U251细胞活力影响；免疫荧光细胞化学法观察U251细胞8淀粉样前体蛋白（APP）的表达；TUNEL法检测TAG-1对U251细胞凋亡形态学变化的影响：Real-time PCR检测TAG-1对U251细胞AICD,p53和EGFR基因表达的调控。结果TAG．1没有抑制U251细胞的生长．相反表现出一定的促生长效应；APP广泛表达于U251细胞膜；在TAG．1浓度为10μg/mL时，U251细胞形态学检测没有发现明显的凋亡细胞，但AICD,p53和EGFR基因表达增加。结论TAG-1在胶质瘤的增殖中发挥重要作用，但未发现其能通过TAG-1／APP／AICD／p53或TAG-1／APP，AJCD／EGFR信号途径促进U251细胞凋亡。; 常海刚姜晓丹陈中灿杨璐军法志强杜谋选; 关键词：神经胶质瘤细胞凋亡

大鼠视觉皮层动态锰离子增强磁共振功能成像研究: 2010年; 目的应用动态锰离子增强磁共振技术行大鼠视觉皮层功能成像，为神经系统功能的研究提供方法。方法成年雄性Wistar大鼠6只，右颈外动脉插管后于连续的4个时段分别进行不同处理，第一时段（5min）不给予药物，无视觉刺激；第二时段（10min）经右颈外动脉注射甘露醇和氯化锰，无视觉刺激；第三时段（15min）仅注射氯化锰，给予视觉刺激；第四时段（5min）注射氯化锰与谷氨酸混合液，无视觉刺激。每一时段处理后立即进行大鼠头颅磁共振成像，应用SPM软件进行图像的配准和平滑处理，应用Matlab软件得出图像的配色图及等高线图：选取视觉皮层进行兴趣区（ROI）分析，观察不同处理后磁共振图像中脑内特异性增强区域并比较大鼠视觉皮层的信号强度。结果磁共振图像分析显示第一、二时段处理后大鼠脑内未发现特异性增强区域。第三时段处理后大鼠右侧视觉皮层特异性增强，第四时段处理后大鼠右侧脑内多个核团特异性增强：ROI分析显示第三时段处理后的视觉皮层信号强度（1．897±0．172）明显强于第二时段（1．549±0．163），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论动态锰离子增强磁共振成像技术能分析大鼠视觉皮层功能活动，可做为研究神经系统功能的新方法。; 张鹏法志强常海刚杨璐军徐如祥姜晓丹; 关键词：磁共振成像视觉皮层

不同分化时间对体外培养大脑皮层神经干细胞分化的影响被引量：1: 2017年; 目的研究不同分化时间对体外单层贴壁培养的大脑皮层神经干细胞（NSCs）分化成星形胶质细胞和神经元的影响。方法（1）体外分离、培养胎鼠大脑皮层原代NSCs，采用细胞免疫荧光染色检测P2代神经球和吹散成单细胞的NSCs中巢蛋白、Sox2的表达；（21取P2代神经球吹散成单细胞，接种于圆玻片上培养过夜，次日更换诱导分化培养基，分别继续培养ld、3d、5d，采用细胞免疫荧光染色检测细胞神经胶质纤维酸性蛋白（GFAPl、Tuj1的表达，分析神经元突起的平均数量、平均最长长度和平均分枝水平；（31取接种于12孔细胞培养板上的NSCs分化样品，采用实时荧光定量PCR检测NSCs不同分化时间点巢蛋白、GFAP、TujlmRNA的表达。结果（11细胞免疫荧光染色检测显示神经球、单层贴壁培养细胞几乎均为巢蛋白和Sox2双阳性细胞，说明培养的细胞几乎全部是NSCs。（21分化3d组、分化5d组NSCs中GFAP’细胞比例高于分化ld组，分化5d组NSCs中Tuil’细胞比例高于分化1d组、分化3d组，差异均有统计学意义（P〈0．05）；分化3d组、分化5d组所分化神经元突起的平均数量、平均分枝水平均高于分化1d组，差异有统计学意义（氏0．051；分化1d组、分化3d组、分化5d组所分化神经元突起的平均最长长度依次增加，差异有统计学意义（P〈0．05）；（3）与分化1d组、分化3d组比较，分化5d组NSCs中巢蛋白mRNA的表达降低，GFAP、TujlmRNA的表达增加，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论随着分化时间的增加，体外单层贴壁培养的NSCs分化出的星形胶质细胞和神经元的数量增多，细胞形态变复杂，神经元突起也越来越成熟，巢蛋白mRNA的表达降低，GFAP和Tuj1 mRNA的表达上升。; 张凤兰杨璐军法志强肖志成; 关键词：神经干细胞细胞分化星形胶质细胞神经元

胎鼠不同脑组织中神经干细胞和神经元所占比例及差异被引量：1: 2017年; 背景:目前,小鼠神经干细胞的体外培养技术已被众多科研平台熟练掌握,但是各科研平台在培养脑源性神经干细胞时所使用的脑组织有很大差异。胎龄14 d(E14)小鼠脑组织被广泛用于培养胎鼠神经干细胞,而对于此时胎鼠不同脑组织中所含神经干细胞的详细比例及其间有无差异,目前研究较少。目的:比较E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中神经干细胞和神经元所占比例及差异,为后期优化分离高纯度神经干细胞提供直接量化数据和前期研究基础。方法:分离E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织,加入胰酶消化成单细胞,贴壁培养3.0-4.0 h,然后通过细胞免疫荧光实验,用DAPI标记总细胞,神经干细胞特异性抗原Nestin标记神经干细胞,神经元特异性抗原Tuj1标记神经元,统计分析Nestin^+/DAPI和Tuj1^+/DAPI所占比例。另外,通过实时荧光定量PCR技术检测E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中Nestin和Tuj1 mR NA的表达水平。结果与结论:(1)细胞免疫荧光结果显示,E14小鼠全脑、大脑皮质和前脑组织中均有大量Nestin^+和Tuj1^+细胞存在;小鼠前脑组织中Nestin^+细胞所占比例最高,明显高于全脑(P<0.01)和大脑皮质(P<0.05);而前脑组织中Tuj1^+细胞比例明显低于全脑(P<0.05)和大脑皮质(P<0.001)。该结果表明,与全脑和大脑皮质相比,前脑组织中神经干细胞所占比例最高,神经元所占比例最低;(2)Real time PCR结果显示,E14小鼠前脑组织中Nestin mR NA表达水平最高,明显高于全脑组织(P<0.05),略高于大脑皮质(P>0.05),说明前脑组织中有较多神经干细胞存在;而Tuj1 mR NA的表达水平明显低于全脑组织(P<0.05)和大脑皮质组织(P<0.05),说明前脑组织中有较少神经元存在;(3)综合以上结果,与全脑和大脑皮质相比,分离、消化E14小鼠前脑组织所获得的神经干细胞比例最高,是后期培养优质神经干细胞的重要前提。; 张凤兰杨璐军肖志成; 关键词：神经干细胞大脑皮质前脑干细胞胎鼠全脑神经元

BDNF转染神经干细胞可降低β-淀粉样蛋白对神经元的毒性被引量：2: 2015年; 目的探讨神经干细胞（NSCs）转染脑源性神经生长因子（BDNF）后对β-淀粉样蛋白（Aβ）毒性作用的抵抗能力及机制。方法用脂质体介导法将BDNF基因转染到C57小鼠NSCs内．经荧光显微镜及ELISA检测转基因NSCs及其分化细胞基因表达情况。体外培养小鼠神经元，将其分成3组：a组为神经元组，b组为神经元与NSCs共培养组，c组为神经元与BDNF转基因NSCs共培养组；每组设2平行组。培养3d后，向其中一平行组加入AB。蛋白，作为d、e、f组。通过ELISA和Western blotting检验记录24h和48h后神经元生存率以及各组Aβ、总tau蛋白、磷酸化tau蛋白水平。结果BDNF转基因干细胞及其子代细胞均有BDNF表达并持续1．5周左右。以a组细胞存活率为参照．24h后d-f组细胞平均存活率分别是51．86％±0．03％、73．68％±0．04％、85．34％±0．01％：48h后d-f组细胞平均存活率分别是38．76％±0．01％、59．65％±0．04％、75．6l％±0．07％；其中d、e组细胞存活率明显低于其他各组，差异有统计意义（P〈0．05）。a-c组Aβ蛋白未能检测到，d-f组Aβ蛋白水平较高，组间差异不具有统计学意义（p〉0．05）。各组细胞总tau蛋白水平差异不具有统计学意义（P〉0．05）。各组磷酸化tau蛋白水平差异有统计学意义（P〈0．05），其中d、e组磷酸化tau蛋白水平显著高于其他各组，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论BDNF转基因NSCs可以持续表达BDNF基因产物，降低Aβ对神经元的毒性作用，同时通过减少细胞内磷酸化tau蛋白的水平提高细胞存活率。; 陈宇新杨璐军张凤兰钟慧霖孙海涛肖志成姜晓丹; 关键词：Β-淀粉样蛋白 TAU蛋白脑源性神经生长因子神经干细胞

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杨璐军

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