郑小凌
- 作品数：8 被引量：12H指数：2
- 供职机构：中山大学中山医学院更多>>
- 发文基金：广东省重大科技专项广州市科技计划项目国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 华支睾吸虫ATP合酶b亚基的组织和亚细胞定位被引量：2
- 2009年
- 目的了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)的虫体组织定位,并以HeLa细胞为替代模型观察其亚细胞定位。方法用CsATP-synt_B重组蛋白免疫SD大鼠,取其抗血清对华支睾吸虫成虫石蜡切片进行间接免疫荧光染色,观察CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫组织中的分布。根据生物信息学预测的CsATP-synt_B线粒体转运序列(MTS序列)和核定位序列(NLS序列)位置,设计4组引物[CsATP-synt_B全长序列,以及3个缺失突变体(MTS-缺失线粒体转运序列、NLS-缺失核定位序列、MTS-NLS-线粒体-核定位双缺失)引物],扩增出全长基因和3个突变体基因,构建重组质粒pEGFP-N1-CsATP-synt_B1-300、pEGFP-N1-CsATP-synt_B30-300、pEGFP-N1-CsATP-synt_B(1-238)+(257-300)及pEGFP-N1-CsATP-synt_B(30-238)+(257-300)。将这些重组质粒用阳离子脂质体转染HeLa细胞,48h后用激光共聚焦显微镜观察CsATP-synt_B全长基因和3个突变体在HeLa细胞的表达和亚细胞定位。结果CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫成虫中分布较为广泛,主要分布在腹吸盘、卵巢、卵黄腺和皮层。绿色荧光蛋白GFP表明CsATP-synt_B全长序列表达于线粒体或细胞核,线粒体转运序列缺失突变体表达于细胞核,核定位序列缺失突变体表达于线粒体,双缺失突变体仅表达于胞浆。结论CsATP-synt_B蛋白在华支睾吸虫的分布与线粒体的分布一致,主要集中在能量代谢较旺盛的组织部位。CsATP-synt_B蛋白既可进入线粒体,也可进入细胞核,理论预测的定位序列得到证实。
- 胡旭初周红娟胡凤玉马长玲赵俊红黄灿郑小凌徐劲余新炳
- 关键词：华支睾吸虫免疫组织化学亚细胞定位
- 华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和重组蛋白的免疫学分析被引量：3
- 2008年
- 目的对新发现的华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)的组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法将华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因(去除了信号肽编码序列)克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白免疫SD大鼠制备抗血清。用蛋白印迹(Western blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠杆菌BL-21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性;并且能识别感染了华支睾吸虫的SD大鼠血清,表明具有免疫反应性。结论华支睾吸虫组织蛋白酶D样天冬氨酸蛋白酶基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
- 赵俊红胡旭初徐劲胡凤玉周红娟胡慧霞郑小凌李艳文余新炳
- 关键词：华支睾吸虫组织蛋白酶D天冬氨酸蛋白酶免疫原性
- 华支睾吸虫溶血磷脂酶在虫体组织定位及其特异性抗体类型分析
- 2008年
- 目的观察华支睾吸虫溶血磷脂酶(CsLysoPLA)在成虫的组织定位,分析其诱导人体产生的特异性抗体类型。方法应用免疫荧光方法,观察CsLysoPLA在成虫的组织定位;应用ELISA方法,CsLysoPLA重组蛋白检测25份华支睾吸虫病人血清的IgG1、IgG2、IgG4、IgE。结果CsLysoPLA定位于虫体的口吸盘、排泄囊、肠支、生殖孔,与虫体分泌/排泄抗原物质密切相关的部位;以CsLysoPLA重组蛋白检测华支睾吸虫感染者血清,IgG1抗体水平较高,IgG2抗体水平稍高,而感染者的IgG4、IgE水平则与健康人无明显差异。结论CsLysoPLA主要经虫体消化道、生殖道、排泄系统分泌/排泄到体外,刺激人体免疫系统产生Th2为主的免疫应答。
- 马长玲胡旭初胡凤玉郑小凌徐劲吕芳丽余新炳
- 关键词：华支睾吸虫溶血磷脂酶
- 华支睾吸虫CsSP19和CsTSP新基因的发现及其表达产物免疫学功能初步研究
- 研究目的
利用生物信息学方法对新发现的华支睾吸虫19kDa分泌蛋白(C．sinensis19kDa secretory protein，CsSP19)和华支睾吸虫睾丸分泌蛋白(Csinensis testieu...
- 郑小凌
- 关键词：华支睾吸虫分泌蛋白分泌排泄抗原肝吸虫病
- 文献传递
- 华支睾吸虫磷脂酶A_2基因生物学特性的初步研究
- 2009年
- 目的对新发现的华支睾吸虫磷脂酶A2(CsPLA2)基因进行生克隆、原核表达,确定该蛋白是否为成虫分泌/排泄蛋白(excretory-secretory protein,ESP)。方法利用多种生物信息学分析软件,从华支睾吸虫全长cDNA质粒文库中识别出CsPLA2样基因,分析该基因表达蛋白的生物学功能特征;将CsPLA2克隆入原核表达质粒pET28a(+),并在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达,蛋白表达产物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;应用Western blot确定CsPLA2是否为ESP;应用免疫荧光方法观察CsPLA2在成虫的组织定位。结果该基因编码307个氨基酸,含有信号肽序列,具有PLA2功能域和活化位点,与谷蛀虫同源蛋白相比,一致性为45%,相似性为52%。PCR、双酶切及DNA测序结果表明pET28a-CsPLA2重组质粒构建成功,SDS-PAGE显示目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中高效表达,表达产物为包涵体。Western blot结果表明CsPLA2是华支睾吸虫的ESP组分之一。虫体免疫组织化学定位显示CsPLA2定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处。结论新发现一个CsPLA2基因,其表达的蛋白定位于虫体的腹吸盘、肠支、睾丸处,为华支睾吸虫成虫ESP组分之一。该基因可在原核表达系统中高效表达。
- 马长玲胡旭初胡凤玉李艳文赵俊红郑小凌余新炳
- 关键词：华支睾吸虫磷脂酶A2基因克隆
- 华支睾吸虫F_0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析被引量：5
- 2007年
- 目的对华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基(CsF0-ATP-synt_B)基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。方法以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F0-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板,扩增该基因(去除线粒体靶向序列的成熟肽基因),将其克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基硫代-!-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠,制备抗血清。蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的免疫原性。结果华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基,编码271个氨基酸,相对分子质量(Mr)为31171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。
- 周红娟胡旭初胡凤玉徐劲马长玲郑小凌陈晓湘余新炳
- 关键词：华支睾吸虫基因克隆原核表达免疫原性
- 华支睾吸虫ATP合酶b亚基模拟亚细胞定位与细胞周期的关系被引量：2
- 2010年
- 目的了解华支睾吸虫ATP合酶b亚基(CsATP-synt_B)核定位序列(NLS)介导该蛋白进入细胞核与细胞周期的关系,及该蛋白对自身和宿主同源基因表达的影响。方法将已构建的CsATP-synt_B与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒(pEGFP-N1-CsATP-synt_B)转染Hela细胞,转染细胞经同步化处理后,在激光共聚焦显微镜下观察在不同细胞周期相,细胞不同部位的荧光分布。流式细胞技术检测该融合蛋白表达量的变化,并通过半定量RT-PCR分析不同细胞周期相CsATP-synt_B和Hela细胞同源基因的表达。结果转染细胞经同步化处理后,流式细胞检测结果显示,空载体pEGFP-N1在G0/G1期Hela细胞中的表达量明显下降,而pEGFP-N1-CsATP-synt_B在该时期表达量呈上升趋势;在其他细胞周期时相,两者的荧光表达量的变化趋势相似。显微镜观察发现,在G0/G1期、S期和G2/M期CsATP-synt_B集中在线粒体表达,G1/S期细胞核内见绿色荧光,且多数细胞的绿色荧光集中见于核仁。在不同的细胞周期,半定量RT-PCR分析结果显示,该重组蛋白进入细胞核后,目的基因CsATP-synt_B和人源性ATP-synt_B(Ho-moATP-synt_B)mRNA的表达均呈上升趋势,CsATP-synt_B上升幅度较大,但两者的表达变化趋势一致。结论 CsATP-synt_B在G1/S期进入细胞核,受细胞能量需求和细胞周期的调控。
- 周红娟余新炳徐劲胡凤玉黄灿赵俊红马长玲郑小凌胡旭初
- 关键词：华支睾吸虫细胞同步化亚细胞定位
- 华支睾吸虫19kDa分泌型蛋白(CsSP19)基因的克隆、表达与免疫学功能研究被引量：1
- 2007年
- 目的对一个新发现的华支睾吸虫分泌型蛋白的未知基因,进行克隆表达和重组产物的免疫学鉴定,确定其免疫学功能。方法利用生物信息学方法从华支睾吸虫成虫全长cDNA质粒文库中发现一个编码分泌型蛋白的新基因(克隆号Cs004f03),将去除信号肽序列的编码序列克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,IPTG诱导表达,产物经亲和层析纯化,并制备大鼠免疫血清,Western-blot方法分析其抗原性和分泌性。结果CsSP19开放阅读框(ORF)有564bp,编码188个氨基酸,理论分子量为21.2kDa,成熟肽的理论分子量为19kDa。该基因的成熟肽编码区在大肠杆菌中可获得高表达,重组蛋白能被华支睾吸虫病人血清所识别,同时,重组蛋白免疫血清也能识别华支睾吸虫分泌排泄抗原中分子量约19kDa的蛋白条带。结论CsSP19蛋白是华支睾吸虫分泌排泄抗原中一个有潜在诊断价值的分泌蛋白。
- 郑小凌胡旭初马长玲周红娟胡慧霞魏泉德赵俊红余新炳
- 关键词：华支睾吸虫分泌蛋白分泌排泄抗原克隆
