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2型猪链球菌AdcR蛋白的原核表达被引量：2: 2015年; 目的表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)调控因子AdcR蛋白,为研究其在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白的作用机制奠定基础。方法通过与相关家族蛋白进行同源性比较,在2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找出编码AdcR的基因。以AdcR基因序列为基础,利用Primer5.0设计引物,采用PCR扩增AdcR基因,经BamHⅠ和HindIII双酶切后将目的片段通过T4DNA连接酶连接至表达载体pET32a,转化大肠埃希菌E.coli BL21,加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L,37℃诱导4h表达AdcR蛋白,然后利用His亲和层析柱纯化AdcR蛋白。结果通过Blast分析,从2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找到编码AdcR的编码基因05SSU0109。以合成的特异引物PCR扩增出469bp的AdcR片段,连接原核表达载体pET32a后转化E.coli,经IPTG 37℃诱导4h,成功表达出AdcR蛋白,其分子质量单位为40ku,与理论值相符。经His-Tag亲和层析纯化,获得较高纯度的重组AdcR蛋白。结论在大肠埃希菌中成功表达了可溶性的AdcR重组蛋白,为AdcR在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白作用机制研究奠定了基础。; 王玲倪华邵珠卿侯田青过雨晴杜世仁胡丹王长军潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌克隆

2型猪链球菌FtsZ重组蛋白的制备及其酶活性测定: 2017年; 目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz,构建重组表达质粒pET28a-ftsz,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物,Ni 2+亲和层析柱纯化重组蛋白,Western blot分析。重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清,间接ELISA法检测抗体效价,用孔雀绿-磷酸检测法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活性。结果成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒;纯化获得大量纯度较高的FtsZ重组蛋白;ELISA检测兔多抗血清效价达1∶13 107 200;Western blot显示FtsZ重组蛋白能够与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应;以GTP为底物检测重组蛋白具有GTP酶活性。结论成功制备了具有GTP酶活性的2型猪链球菌FtsZ重组蛋白并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究2型猪链球菌FtsZ在细胞分裂调控过程中的作用奠定基础。; 范伟伟倪华孙卫平张剑李超龙吴倩倩王长军潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌纯化

猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用: 本发明属于基因工程领域，涉及猪链球菌2型divIVA基因敲除突变株及其应用。所述突变株ΔdivIV制备方法为：利用同源重组基因敲除技术将S.suis 2野生株05ZYH33染色体上编码DivIVA蛋白的divIVA基因进...; 潘秀珍倪华王长军沈玉洁胡丹郑峰; 文献传递

2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA的原核表达及纯化被引量：3: 2016年; 目的利用原核表达系统制备2型猪链球菌细胞分裂起始因子DivIVA重组蛋白并进行纯化,为研究其在调控细胞分裂中的作用奠定基础。方法以2型猪链球菌05ZYH33全基因组为模板,PCR扩增divIVA基因片段,经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后将目的片段连接至表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a-divIVA,经测序鉴定后将重组质粒转化进入表达菌E.coli BL21,以终浓度为0.1mmol/L的IPTG于37℃培养4h,诱导DivIVA蛋白表达。用Ni离子亲和层析柱分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。结果成功构建重组表达质粒pET28a-divIVA,并在E.coli BL21中表达主要以包涵体形式存在的DivIVA蛋白。包涵体蛋白经8mol/L脲变性溶解后经Ni离子亲和层析柱纯化,获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测分子质量为36ku,与预期大小相符;经Western blot检测,该蛋白能被相应抗体特异性识别。结论在E.coli BL21中成功表达并纯化了DivIVA蛋白,为研究该蛋白在2型猪链球菌的细胞分裂机制奠定了基础。; 倪华过雨晴杜世仁张剑范伟伟孙卫平王长军曹祥荣潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌

2型猪链球菌细胞分裂基因divIVA生物学功能初步研究: 猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是重要人兽共患病病原菌,可使猪或人感染引发多种疾病。其中2型猪链球菌(S.suis 2)致病性最强,可使人感染患脑膜炎、败血症、心内膜炎甚至中毒性休克综合征。...; 倪华; 关键词：2型猪链球菌基因敲除技术; 文献传递

2型猪链球菌FtsZ细胞分裂相关蛋白原核表达: 近年来真核样丝苏氨酸激酶STK在重要病原菌细胞信号转导中的作用越来越受到重视,STK对细菌毒力、表型、生长等多方面具有调控作用,在细胞分裂方面STK能够磷酸化细胞分裂的关键蛋白FtsZ (Filamenting temp...; 倪华过雨晴杜世仁张剑范伟伟孙卫平王长军潘秀珍

2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA基因功能研究: 目的：通过构建2型猪链球菌(SS2)细胞分裂调控蛋白divIVA基因突变株△divIVA,研究该基因在调控细胞分裂及SS2致病性中的作用. 方法：构建中间携有壮观霉素(Spc)抗性,两端为divIVA基因同源臂...; 倪华过雨晴杜世仁张剑范伟伟孙卫平王长军曹祥荣潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌细胞分裂蛋白表达; 文献传递

2型猪链球菌中国强毒株及其covR基因突变株的蛋白质组学研究: 2016年; 目的通过比较2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33及其covR基因突变株△covR蛋白表达谱差异,质谱鉴定差异表达蛋白,分析CovR在蛋白表达调控中的作用。方法首先将05ZYH33和△covR在THB培养基中培养至对数期,然后裂解细菌制备蛋白样品。第一向等电聚焦电泳在pH3～10的IPG胶条上完成后进行SDS-PAGE电泳,电泳胶经扫描分析后选取蛋白点进行质谱鉴定。结果 05ZYH33和△covR全菌蛋白裂解液经二维电泳分别得到559和491个蛋白点,经比对发现两菌株蛋白表达量差异3倍以上蛋白点40个,经质谱鉴定出15个蛋白,主要涉及细胞代谢的酶类如谷氨酸脱氢酶、腺苷酸激酶、PTS系统成分等,以及分子伴侣蛋白如GroEL和Dnak等;电泳分离得到△covR特异蛋白点124个,质谱鉴定出15个,主要为参与细胞糖代谢过程中的酶,如磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶等;质谱鉴定05ZYH33特异表达蛋白5个。结论鉴定05ZYH33和△covR差异表达蛋白35个,部分蛋白涉及细菌毒力、宿主细胞粘附、细胞分裂等生命过程,同时蛋白分子伴侣在△covR中的表达变化说明CovR的调控可能发生在蛋白修饰水平,为研究CovR在调控细菌毒力中的作用和分子机制奠定基础。; 倪华张剑郑峰胡丹李先富王长军潘秀珍; 关键词：2型猪链球菌二维电泳蛋白质组

2型猪链球菌丝氨酸/苏氨酸激酶对细菌生物学特性的影响被引量：3: 2014年; 猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌,有33个血清型[1].2型猪链球菌致病力最强,可引起脑膜炎、关节炎、败血症等[2].信号转导系统对细菌应对外界复杂的环境变化有着重要的作用.本课题组前期在对2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组测序的研究中发现和真核生物同源的丝氨酸/苏氨酸激酶stk,利用同源重组原理成功构建了stk基因敲除突变株[3],本文进一步研究stk缺失后细菌生物学特性的变化.; 杜骁杰倪华王玲郑峰胡丹王长军潘秀珍; 关键词：生物学特性苏氨酸激酶猪链球菌细菌信号转导系统人兽共患病

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倪华

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