孔聪
- 作品数：7 被引量：10H指数：2
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- 结核分枝杆菌新型抗原Rv3400的免疫原性研究被引量：4
- 2016年
- 目的用结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）特异性抗原Rv3400联合弗氏不完全佐剂（incom-pleteFreund’s adjuvant，IFA）构建结核亚单位疫苗（Rv3400-IFA），在C57BL／6小鼠体内评估其免疫效应。体外用抗原Rv3400感染巨噬细胞RAW264．7并评估其免疫应答。方法PCR扩增基因Rv3400，构建重组质粒pET28a（＋）-Rv3400，转人大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，诱导表达并纯化Rv3400蛋白。用抗原Rv3400、阳性对照脂多糖（1ipop01ysaccharides，LPS），分别刺激小鼠巨噬细胞RAw264．7，阴性对照为未刺激的巨噬细胞，流式细胞术检测细胞表面分子表达，收集细胞培养上清，ELISA检测细胞因子的分泌。另一方面纯化的Rv3400蛋白与IFA充分乳化构建亚单位疫苗免疫小鼠；C57BL／6小鼠采用数字表法随机分为3组，分别为实验组Rv3400组、阳性对照组Rv3425组、阴性对照组IFA组，每组5只，每2周1次、共免疫3次。分别采用酶联免疫斑点检测技术（enzyme-linkedimmunospotassay，ELISPOT）和酶联免疫吸附测定（ELISA）技术对免疫小鼠的细胞免疫和体液免疫进行评估。结果（1）成功克隆表达并纯化结核分枝杆菌特异性抗原Rv3400。（2）体外细胞实验结果显示：Rv3400抗原刺激巨噬细胞，其表面分子CD80、CD86、CD40、MHCII表达量显著提高，阳性细胞比率[分别由未刺激的（34．70±2．40）％、（31．25±18．31）％、（41．80±6．01）％、（44．30±0．44）％提高至1μg/mlRv3400抗原刺激后的（90．45±7．71）％、（90．10±4．10）％、（89．97±7．79）％、（85．13±5．12）％]；能促进细胞分泌高水平的肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-a，TNF-a）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），分别达（49217．0±390．61）pg／ml、（1783．4±51．18）pg／ml。（3）免疫小鼠后，ELISPOT结果显示：实验组Rv3400组小鼠分泌INF-7的斑点形成细胞（spotfo
- 朱琳徐颖孔聪粟海波黄琪朱胜玲王洪海
- 关键词：分枝杆菌结核亚单位疫苗细胞免疫体液免疫
- 表达抗原 Rv3478的重组卡介苗的实验研究
- 2015年
- 目的：本研究选取结核杆菌优秀抗原Rv3478，构建重组疫苗rBCG：Rv3478并对其进行免疫原性评价。方法 PCR扩增基因Rv3478，构建重组质粒Rv3478-pMV261之后电转进入BCG感受态细胞中，另外将扩增的基因片段导入pET-28a中，构建表达载体Rv3478-pET-28a（ BL21）表达蛋白Rv3478，蛋白免疫小鼠获取多克隆抗体，蛋白印迹方法筛选得到表达Rv3478的重组卡介苗；用构建好的重组卡介苗刺激巨噬细胞，收集细胞培养上清 ELISA 检测细胞因子的分泌；重组疫苗rBCG：Rv3478（R3）免疫小鼠，PBS、BCG、BCG：pMV261（R0）作对照组。分别在免疫4周和12周后处死小鼠，用ELISPOT、ELISA、流式细胞术等方法检测疫苗细胞免疫和体液免疫水平。结果成功表达蛋白Rv3478，免疫小鼠后获得多克隆抗体；成功构建重组疫苗R3；免疫小鼠后，能够引发强烈的细胞免疫应答（强烈的IFN-γ反应，高水平的TNF-α的分泌），促进外周血CD4＋／CD8＋T细胞比例增加， CD44＋CD62L＋T细胞百分比增加。结论构建的重组疫苗R3能够引发强烈的免疫应答，显示出良好的免疫原性，具有良好的抗结核潜力，值得进一步研究。
- 孔聪朱琳粟海波黄琪李光华宋娜徐颖王洪海
- 关键词：结核病重组卡介苗疫苗
- 一种促凋亡重组卡介苗及其制备方法
- 本发明属于遗传工程和结核病疫苗研究技术领域，具体为一种促凋亡重组卡介苗及其制备方法。其通过在大肠杆菌—分枝杆菌穿梭质粒pMV261中依次插入结核保护性抗原Ag85B的信号肽ASP和促细胞凋亡基因BAX先得到重组质粒，再将...
- 王洪海李光华徐颖刘国元宋娜孔聪黄琪
- 一种促凋亡重组卡介苗及其制备方法
- 本发明属于遗传工程和结核病疫苗研究技术领域，具体为一种促凋亡重组卡介苗及其制备方法。其通过在大肠杆菌—分枝杆菌穿梭质粒pMV261中依次插入结核保护性抗原Ag85B的信号肽ASP和促细胞凋亡基因BAX先得到重组质粒<...
- 王洪海李光华徐颖刘国元宋娜孔聪黄琪
- 文献传递
- 针对潜伏结核感染的A39 DNA疫苗构建及其免疫原性研究被引量：5
- 2015年
- 选取结核分枝杆菌潜伏相关抗原Rv2029c、结核分枝杆菌优秀抗原Ag85A和Rv3425,构建针对潜伏感染的结核分枝杆菌DNA疫苗pVAXI/Ag85A-Rv3425-Rv2029c(A39),并对其免疫原性进行研究。首先用聚合酶链反应(PCR)扩增Ag85A基因,构建重组质粒pVAX1/Ag85A(A);PCR扩增Ag85A-Rv3425连接片段,插入pVAX1载体,构建重组质粒pVAX1/Ag85A-Rv3425(A3);PCR扩增Rv2029c基因,插入A3,构建重组质粒pVAX1/Ag85A-Rv3425-Rv2029c(A39)。将构建成功的重组质粒转入HEK293T细胞,蛋白免疫印迹法验证质粒在真核细胞中得到表达。在大肠埃希菌BL21中成功表达和纯化去除信号肽的Ag85A、Rv3425和Rv2029c蛋白。用质粒免疫C57BL/6小鼠,共分为5组:PBS、pVAX1、A、A3和A39组,采用电脉冲导入免疫,每2周免疫1次,共3次,用酶联免疫斑点检测(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、流式细胞术等方法检测细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,A39免疫小鼠后,能引发强烈的细胞免疫反应[γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素2(IL-2)高水平分泌],外周血CD4^+/CD8^+T细胞比值增加,CD8^+穿孔素^+T细胞比例增加。结果表明,构建的A39 DNA疫苗能引发强烈的免疫反应,显示出良好的抗结核潜力,可作为结核分枝杆菌新型候选疫苗。
- 宋娜李光华黄琪孔聪王洪海徐颖
- 关键词：结核分枝杆菌DNA疫苗潜伏结核感染AG85A
- 结核分枝杆菌Rv3425与Rv3614c的相互作用被引量：1
- 2015年
- 为探究结核分枝杆菌脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸(PPE)蛋白家族Rv3425的生物学功能,利用免疫共沉淀联合质谱分析,在卡介苗(BCG)中筛选与Rv3425相互作用的蛋白。首先,以聚合酶链反应(PCR)扩增获得Rv3425基因,并克隆于pMV261载体。将重组载体转化入BCG,裂解细胞,蛋白免疫印迹法证实目的蛋白可在BCG中表达。通过免疫共沉淀,用特异抗体分离出BCG中的Rv3425蛋白复合体,质谱鉴定其成分,在美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中检索各蛋白的功能,筛选与Rv3425相互作用的蛋白,并用谷胱甘肽S-转移酶(GST)pulldown验证。结果显示,免疫共沉淀联合质谱分析筛选到10个与Rv3425相互作用的蛋白,在细胞内Rv3425协同作用下参与肽聚糖合成途径、分枝菌酸合成途径、ESX-1蛋白分泌系统及细菌毒力调控。GST pulldown验证发现Rv3614c与Rv3425可体外结合。本研究证实Rv3425与Rv3614c存在相互作用,Rv3425可能与ESX-1蛋白分泌系统及结核分枝杆菌致病机制密切相关。
- 黄琪徐文玺粟海波李光华宋娜孔聪朱琳王洪海徐颖
- 关键词：结核分枝杆菌免疫共沉淀蛋白质相互作用
- 一种促凋亡重组卡介苗及其制备方法
- 本发明属于遗传工程和结核病疫苗研究技术领域，具体为一种促凋亡重组卡介苗及其制备方法。其通过在大肠杆菌—分枝杆菌穿梭质粒pMV261中依次插入结核保护性抗原Ag85B和促细胞凋亡基因BAX先得到重组质粒，再将重组质粒电转入...
- 王洪海徐颖李光华刘国元宋娜孔聪黄琪
- 文献传递
