万俐娟
- 作品数：2 被引量：4H指数：1
- 供职机构：安徽医科大学基础医学院生物化学教研室更多>>
- 发文基金：霍英东青年教师基金国家级大学生创新创业训练计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫株的建立及鉴定
- 2015年
- 目的构建并鉴定高表达毒力因子ROP18的转基因刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)虫株。方法 RTPCR扩增刚地弓形虫RH株速殖子的ROP18基因片段。将纯化的PCR产物克隆至p CR-BluntⅡ-Topo载体构建p ROP18质粒,PCR扩增ROP18基因序列。将纯化的PCR产物亚克隆至p TUB8-myc GFPPftail-Ty1载体,构建p TUB8-ROP18-Ty1质粒。将质粒电穿孔转染刚地弓形虫RH株,刚地弓形虫悬液转移到长有贴壁细胞的培养瓶中培养,用含25μg/ml霉酚酸和50μg/ml黄嘌呤的DMEM培养基筛选高表达ROP18的刚地弓形虫RH株。免疫荧光和蛋白质印迹(Western blotting)检测ROP18在转基因刚地弓形虫株中的表达。吉氏染色比较弓形虫RH株和高表达ROP18的转基因RH株弓形虫分别感染人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的增殖情况。20只昆明小鼠均分为2组,每鼠分别腹腔内注射1×103高表达ROP18弓形虫RH株和1×103弓形虫RH株,统计小鼠存活率。结果 RT-PCR扩增出1 665 bp的ROP18基因序列。经酶切和测序鉴定证明p TUB8-ROP18-Ty1质粒构建成功。Western blotting分析结果显示,高表达ROP18 RH株可表达相对分子质量(Mr)为56 000的蛋白,与ROP18-Ty1蛋白预期结果一致。免疫荧光结果发现,ROP18-Ty1定位于弓形虫前端的棒状体。吉氏染色结果表明,高表达ROP18 RH株弓形虫感染HFF细胞6、12和24 h后的速殖子数量分别为100.0±16.9、476.0±31.1和860.0±52.3,均显著高于RH株弓形虫(88.0±16.9,300.0±11.3,675.0±35.4)(P<0.05)。弓形虫毒力实验结果显示,RH株弓形虫感染小鼠在第8天均存活,第14天存活率下降至30%(3/10),至第16天全部死亡;高表达ROP18 RH株弓形虫感染小鼠在第5天均存活,第8天存活率下降至30%(3/10),至第9天全部死亡。结论构建了高表达毒力因子ROP18的转基因弓形虫虫株。
- 蒋宗儒安然杨杰万俐娟都建
- 关键词：弓形虫
- 葡萄糖调节蛋白78与糖尿病因素影响瑞芬太尼后处理心肌保护作用的关系：离体实验被引量：4
- 2015年
- 目的 评价葡萄糖调节蛋白78（GRP78）与糖尿病因素影响瑞芬太尼后处理心肌保护作用的关系.方法 H9c2细胞在含10％胎牛血清DMEM/F12培养基中培养、传代,接种于96孔板（100μl/孔）或6孔板（2 ml/孔）,接种密度10 5个/ml,接种12 h后细胞贴壁.采用随机数字表法,将细胞分为6组（n=24）：正常糖对照组（NC组）、正常糖缺氧复氧组（NHR组）、正常糖瑞芬太尼后处理组（NRP组）、高糖对照组（HC组）、高糖缺氧复氧组（HHR组）和高糖瑞芬太尼后处理组（HRP组）.NC组、NHR组和NRP组细胞换用正常糖DMEM培养基（5.5 mmol/L）培养48 h;HC组、HHR组和HRP组细胞换用高糖DMEM培养基（25.0 mmol/L）孵育48 h.NHR组、NRP组、HHR组和HRP组弃去培养液,加入Tyrode液,将培养板置于95％N2-5％CO2培养罐中孵育5h,NHR组和HHR组更换为含10％胎牛血清的相应糖DMEM培养基孵育1h,NRP组和HRP组更换为含终浓度为1μmol/L瑞芬太尼的DMEM培养基孵育1h.于复氧1h时,每组取9孔细胞,采用CCK8法检测细胞活力;每组取12孔细胞,采用化学比色法测定培养液乳酸脱氢酶（LDH）活性;每组取3孔细胞,采用Western blot法测定GRP78表达.结果 与NC组比较,NHR组细胞活力降低,LDH活性升高,GRP78表达上调（P＜0.05）;与NHR组比较,NRP组细胞活力升高,LDH活性降低,GRP78表达下调,HRP组细胞活力降低,LDH活性升高,GRP78表达上调（P＜0.05）;与HC组比较,HHR组细胞活力降低,LDH活性升高,GRP78表达上调（P＜0.05）;与HHR组比较,HRP组细胞活力、LDH活性和GRP78表达差异无统计学意义（P＞0.05）;与NRP组比较,HRP组细胞活力降低,LDH活性升高,GRP78表达上调（P＜0.05）.结论 糖尿病因素取消瑞芬太尼后处理心肌保护作用的机制可能与其上调GRP78的表达有关.
- 陈满丽陈立建万俐娟张雷都建顾尔伟
- 关键词：热休克蛋白质类糖尿病哌啶类缺血后处理
