蔡峰
- 作品数：10 被引量：4H指数：1
- 供职机构：成都生物制品研究所有限责任公司更多>>
- 发文基金：“重大新药创制”科技重大专项国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学理学更多>>
- 登革病毒1型E蛋白第三结构域的原核表达及其免疫原性
- 2014年
- 目的在大肠埃希菌中表达登革病毒(Dengue virus,DENV)1型(DENV-1)E蛋白第三结构域(EⅢ),并分析重组蛋白的免疫原性。方法利用PCR技术从质粒p MD-D1pr M/E中扩增DENV-1的EⅢ序列,插入原核表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒p ET-D1EⅢ,转化至E.coli Rosetta2(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经亲和层析和阴离子交换层析纯化后,免疫家兔,制备多克隆抗体,采用Western blot法检测抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体滴度,蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)检测中和抗体效价。用纯化的重组蛋白免疫经腹部皮下多点注射BALB/c小鼠3次,末次免疫2周后,用DENV-1(Hawaii株)经脑内攻击,分析重组蛋白对小鼠的免疫保护力。结果重组原核表达质粒p ET-D1EⅢ经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为33 000,主要以可溶性形式表达,占重组菌裂解上清蛋白量的52.37%;纯化的纯度可达90%以上,浓度达2 mg/ml;制备的多克隆抗体特异性强,效价高;重组蛋白能保护57.1%的小鼠免受致死剂量DENV的攻击。结论成功在E.coli Rossetta2(DE3)中高效表达了DENV-1 EⅢ蛋白,纯化的重组蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体具有较强的特异性和较高的效价,且在小鼠免疫保护试验中显示出较好的保护力。本实验为进一步研究E蛋白的功能和登革新型疫苗的开发奠定了基础。
- 汪伟李竹石谭帅赵宇刘莉娜刘俐蔡峰曾献武杨会强
- 关键词：登革病毒E蛋白原核细胞免疫原性免疫保护力
- 诺如病毒衣壳蛋白在Tn5细胞中的表达及纯化
- 2017年
- 将人诺如病毒VA387株ORF2基因插入载体pFastBac1中,转化DH10Bac感受态细胞获得Bacmid-NoV-ORF2;脂质体介导转染sf9昆虫细胞,获得表达NoV-ORF2的重组杆状病毒Ac-NoV-ORF2.冻融破碎经Ac-NoV-ORF2感染的Tn5细胞,离心收集上清进行分子筛纯化.10%SDS-PAGE分析结果显示,重组病毒感染的Tn5细胞可见特异的蛋白条带;目的蛋白条带为相对分子质量59kD和56kD的两个条带;电镜观察发现表达的诺如病毒衣壳蛋白成功装配成了大小约为40~50nm的VLPs.结果表明在Tn5细胞中实现了诺如病毒衣壳蛋白的表达和VLPs的装配.
- 马玉晓刘兰军李玫颖张勇侠蔡峰代云见范凤鸣张雪梅赵云
- 关键词：诺如病毒病毒样颗粒
- Triton X-100含量的高效液相色谱检测方法
- 本发明公开了一种Triton？X-100定量检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，步骤如下：(1)制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；(2)制备对照品溶液：取标准品Triton？X-100，溶于水，制成对照品溶液...
- 秦敏杨国友唐浩蔡峰
- 文献传递
- 采用DoE设计方法优化可溶性肿瘤坏死因子I型受体蛋白的聚乙二醇修饰工艺被引量：1
- 2013年
- 目的 采用DoE设计方法对人可溶性肿瘤坏死因子I型受体（soluble tumour necrosis factorαreceptors I,sTNFα-R玉）的聚乙二醇（PEG）修饰工艺参数进行优化,以期获得稳定、可控的工艺参数。方法 采用UNICORN（DoE）软件中Central Composite Face Centered（CCF）模型对sTNFα-R玉的3个PEG修饰工艺参数,即溶液pH值（pH）、反应时间（Time）和PEG与蛋白质量比（PEGrate）进行优化,设置4个响应值（多PEG修饰蛋白峰面积、单PEG修饰蛋白峰面积、未修饰蛋白峰面积及单PEG修饰蛋白峰面积与多PEG修饰蛋白峰面积比值）揭示其化学反应过程,确定参数操作空间;应用蒙特-卡罗模拟法（Monte-Carlo Simulation）对优化参数进行风险评估。结果3因子17组试验结果的重复性较好,中心点重复组响应值介于最低值和最高值之间,且随机分布,符合DoE试验设计的要求;4个响应值所对应的回归系数（R2）均〉0.75,预测准确性（Q2）〉0.5,模型有效性（Model Validity）〉0.25,重复性（Reproducibility）〉0.5,模型预测与实验值之间偏差较小,具有可靠的预测准确性;17组试验结果标准残差在允许范围（-4～4）之间,线性较好,预测值与观测值之间相关性较好,建立的模型拟合度高,可较为准确地预测试验结果。溶液pH值对多PEG修饰产量影响较小,随着Time和PEGrate的升高,多PEG修饰产物增加,单PEG修饰产物经二次或多次修饰形成多PEG修饰产物,减少Time和PEG用量可减少多PEG修饰产物;单PEG修饰产物随着pH上升,产量有所增加,与Time呈二次项关系,在Time.PEGrate交互作用中,减少PEG用量可增加单PEG修饰产物量;减少Time和降低PEG用量可提高单PEG修饰产物与多PEG修饰产物的比值,有利于下游纯化。确定了工艺参数的操作空间,当pH为5.5时,反应时间控制在30 h以上,PEG与蛋白质量比控制在3.7以下,符合预设值;pH在6.5时,反应时间控制在22～35 h之间,PEG与蛋白质量
- 王保成蔡峰李坤李春阳张珂秦娇荣
- 关键词：肿瘤坏死因子Α受体PEG修饰DOE
- 响应面法优化检测己二酸二肼衍化后破伤风类毒素纯度的排阻型高效液相法
- 2016年
- 目的响应面法优化检测己二酸二肼(adipate hydrazine,ADH)衍化后破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)纯度的排阻型高效液相(SEC-HPLC)法。方法 SEC-HPLC层析柱Superdex 200 increase 3.2/300流动相为:20 mmol/L Na_2CO_3/NaHCO_3,150 mmol/L NaCl,pH 9.0,柱温25℃,单针检测时间60 min。采用响应面法及中心复合表面设计模型(Central Composite Face-centred,CCF)对层析柱的流速、进样量、样品浓度进行优化,通过分离度、峰对称性、峰理论塔板数、单针进样时间等评价指标,确定最优色谱参数,并在最优色谱参数下连续进样100针,验证其分离效果。结果色谱柱的最优色谱条件为:流速50μl/min,进样量5μl,样品浓度1.0 mg/ml,连续进样100针各响应量均满足优化目标。结论成功采用响应面法优化了检测ADH衍化后TT纯度的SEC-HPLC法,且优化后的方法具有良好的稳定性。
- 蔡峰马诚蓝天陈思周觉非赵祥宇杨溢尧崔长法
- 关键词：响应面法破伤风类毒素纯度
- 基于响应面设计的百日咳粘附素浸提工艺优化
- 2013年
- 百日咳粘附素(PRN)是无细胞百日咳疫苗的重要保护性抗原之一,优化其浸提工艺对提高PRN产量、纯度乃至百日咳疫苗的质量都具有重要意义.通过中心复合表面设计(CCF)响应面模型和ELISA定量分析相结合的方法研究了影响PRN浸提工艺的关键因素.经两轮CCF响应面优化,确定了PRN浸提的最优工艺参数:温度60℃,菌浓度50 mg/mL,时间90 min,p H 8.5,NaCl 0.15 mol/L;通过Monte Carlo模拟和Plackett Burman模型设计预测和验证了工艺稳健性参数范围:温度58-62℃,菌浓度40-60 mg/mL,时间80-100 min,pH 8.45-8.55,NaCl 0.12-0.18 mol/L.响应面优化后,粗提液PRN产量提高了50%.研究表明,温度对PRN浸提影响最大,其次是pH;菌浓度、时间及NaCl含量的影响相对较小,但与温度、pH有交互作用.
- 张飞伟赵祥宇蔡峰周晓舟刘晓凤秦敏
- 关键词：百日咳响应面浸提
- 实验设计法优化可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体包涵体的复性工艺
- 2018年
- 目的通过实验设计(Design of Experiment,DoE)方法对重组的可溶性人肿瘤坏死因子αⅠ型受体(soluble tumor necrosis factorαreceptorⅠ,sTNFαRⅠ)包涵体复性工艺中的关键参数进行优化。方法采用DoE软件中的中心复合设计(Central Composite Design)建立二次模型(Quadratic Model),对复性工艺中游离巯基浓度(C_(-SH))和复性液蛋白浓度(C-Pro)2个关键参数进行优化。设置2个响应值:每克湿菌体中所获得的sTNFαRⅠ蛋白收率和每制备10 g sTNFαRⅠ蛋白所需复性体积(V-10 g),通过DoE软件对模型数据进行评估分析。在sTNFαRⅠ收率最高及V_(-10g)最小的前提下,采用二次模型响应面分析预测最优的复性参数值,并通过两次放大试验对优化结果进行验证。结果由2因素5水平2个Block共14组试验结果所建立的DoE响应面二次模型中心点重复性好,试验点均符合正态分布。响应面二次回归分析中,分别以sTNFαRⅠ收率和V_(-10g)作为响应值进行失拟检验的P均>0.05,模型失拟不显著。预测值和真实值接近,模型拟合度好。信噪比均>4,表明该模型有效,可用于复性工艺优化指导。通过以上模型得出:当C_(-Pro)为0.48 mg/m L,复性起始C_(-SH)为8.69 mmol/L时模型愿望值(0.643)最高,sTNFαRⅠ收率为16.38 mg/g,V_(-10g)为36.73 L。通过两次放大试验对优化结果进行验证,sTNFαRⅠ收率分别为11.34和9.72 mg/g,与优化前(收率均值5.1 mg/g)相比,有所提高。结论 DoE软件中心复合设计的二次模型可用于sTNFαRⅠ包涵体复性条件的筛选,且筛选结果为后续工艺放大提供了可靠的实验依据。
- 秦娇荣蔡峰赵兆代云见李春阳
- 关键词：包涵体复性响应面
- 重组人肿瘤坏死因子受体Ⅰ蛋白复性过程中巯基浓度的监测被引量：1
- 2013年
- 目的建立一种在重组人肿瘤坏死因子受体Ⅰ（tumor necrosis factor receptorⅠ，TNFRⅠ）蛋白复性过程中简单、可靠且易于操作的巯基浓度的监测方法，用以指导、监控蛋白复性过程及终点判断。方法通过测定3种不同巯基浓度检测方法的线性范围及相关系数，建立适合重组人TNFRI蛋白复性溶液中巯基浓度的测定方法；动态监测蛋白复性过程中溶液巯基浓度变化及巯基浓度与复性蛋白生物活性的相关性；于蛋白复性48、96和144h取样，检测4℃保存3d和6d的稳定性。结果采用的3种巯基浓度监测方法中，方法3标准偏差值（standard error value，STDEV）较小，线性范围在0～12．5mmol／L，线性关系较好，R^2=0．9999，更适于蛋白复性溶液中巯基浓度的监测；随着蛋白复性时间的延长，巯基浓度呈明显的下降趋势（R^2=0．9891），当浓度在2～1mmol／L下降期间，是复性蛋白细胞活性上升最快期，而当巯基浓度降至1mmol／L及以下时，细胞活性达到最大值；蛋白复性144h后，细胞活性较为稳定。结论建立了一种简单、可靠且易于操作的巯基浓度测定方法，该方法对提高包涵体的复性效率具有重要的参考价值。
- 王保成李坤李春阳蔡峰秦娇荣
- 关键词：蛋白质复性巯基细胞活性
- A群C群脑膜炎球菌结合疫苗游离蛋白含量HPLC检测方法的建立被引量：2
- 2016年
- 目的建立A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量的HPLC检测方法,并对其进行验证。方法采用HPLC法,色谱条件:色谱柱:TSKgel G3000SW(300 mm×7.5 mm,10μm);流动相:0.01 mol/L磷酸盐缓冲液[pH(7.2±0.2)];流速:0.5 ml/min,自动进样100μl;检测波长:280 nm;柱温:室温。对该方法进行专属性、分离度、线性、精密性和准确性验证,确定该方法的定量限和检测限;应用建立的方法检测3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液及A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品中游离蛋白含量。结果该方法检测游离蛋白的专属性、分离度良好;蛋白对照品在3~18μg/ml范围内,标准曲线的线性关系良好,R^2=0.998;3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品的加样回收率在82.9%~119.33%之间,RSD小于5%;确定方法检测限为1.0μg/ml,定量限为2.6μg/ml。3批A、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液和A群C群脑膜炎球菌结合疫苗成品未检测出游离蛋白。结论建立的HPLC法简便、灵敏、准确度高,可检测A群C群脑膜炎球菌结合疫苗中游离蛋白含量。
- 刘璐蔡峰王公孝王学林许蓉华熊慧玲
- 关键词：高效液相色谱法
- Triton X-100含量的高效液相色谱检测方法
- 本发明公开了一种Triton X-100定量检测方法，它是采用高效液相色谱法检测，步骤如下：(1)制备供试品溶液：取待检样品，制成供试品溶液；(2)制备对照品溶液：取标准品Triton X-100，溶于水，制成对照品溶液...
- 秦敏杨国友唐浩蔡峰
- 文献传递
