目的揭示肥胖诱发脂肪组织线粒体蛋白质组的变化,并探索变化的可能机制,实现针对小鼠脂肪组织线粒体蛋白质组的深度测序和准确定量。方法利用数据依赖型(DDA)质谱方法鉴定小鼠白色脂肪组织和棕色脂肪组织中的线粒体蛋白;利用新型SWATH(sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra)质谱技术定量肥胖小鼠和野生型小鼠不同脂肪组织中线粒体蛋白,同时对表达差异的线粒体蛋白进行功能分析。实验步骤:1用组织线粒体提取试剂盒特异性提取不同类型脂肪组织线粒体蛋白;2用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳预分离线粒体蛋白;3利用DDA方法建立线粒体蛋白质谱文库;4利用SWATH质谱方法定量线粒体蛋白;5利用Peak View2.0软件提取碎片离子色谱峰并进行积分计算其峰面积;6根据KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路和GO(Gene Ontology)功能分类分析肥胖小鼠和正常小鼠脂肪组织表达差异蛋白的生物功能。结果在白色脂肪组织和棕色脂肪组织分别准确鉴定并定量线粒体定位蛋白1000和1039种,3次生物学重复实验中共鉴定包括线粒体氨肟还原成分1在内的25种线粒体蛋白在白色脂肪组织特异性表达,包括非偶联蛋白3在内的21种线粒体蛋白在棕色脂肪组织特异性表达。肥胖小鼠与正常小鼠相比,白色脂肪组织中共有25种线粒体蛋白表达显著上调(上调倍数≥2,P<0.01),有47种线粒体蛋白表达显著下调(下调倍数≥2,P<0.01);棕色脂肪组织中有26种线粒体蛋白表达显著上调(上调倍数≥2,P<0.01),有21种线粒体蛋白表达显著下调(下调倍数≥2,P<0.01)。结论脂肪组织线粒体蛋白质组的定量及生物信息学的分析表明,肥胖导致线粒体内三羧酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸的合成和降解以及对外源性物质的代谢等重要的信号通路发生紊乱,并准确鉴定、定量其相关表达差异蛋白,为肥胖导致代谢紊乱的
目的:建立由于油酸大量摄入造成的HepG2细胞脂肪变性模型;发现HepG2细胞发生脂肪变性前、后转录因子DNA结合活性的差异。方法:将HepG2细胞在含2mmol/L油酸的培养基中培养24h,通过油红O染色鉴定细胞中的甘油三酯含量,并确定发生脂肪变性的程度。分别提取对照组和实验组的核蛋白,利用转录因子富集技术cat TFRE(a concatenated tandem array of the consensus transcription factor response element),同时运用深度覆盖的蛋白质组学手段,对HepG2细胞脂肪变性前、后的转录因子变化进行动态描绘和定量分析。最后,利用IPA(integrated pathway analysis)对DNA结合活性发生改变的转录因子进行功能分析。结果:对照组总共鉴定到170种转录因子,实验组总共鉴定到190种转录因子,两组总共鉴定到208种转录因子。HepG2细胞发生脂肪变性后,DNA结合活性发生变化的转录因子有101种(重复实验间差异小于2倍,不同处理间差异大于2倍),DNA结合活性加强的有67种,减弱的有34种。其中,调节糖代谢、脂代谢的关键转录因子MLX、MLXIPL的DNA结合活性减弱;NF-κB1的DNA结合活性增加,暗示了NF-κB介导的炎症反应的激活。IPA分析的结果表明,油酸激活了HepG2细胞内NRF2介导的氧化应激反应,促进了基因表达(gene expression)、细胞增殖(cell proliferation)、细胞分化(differentiation of cell)、细胞周期(cell cycle)及细胞存活(cell survival)的进程。结论:油酸诱导HepG2细胞脂肪变性会引起细胞内糖、脂代谢的紊乱,诱发炎症反应,并引起氧化损伤,但是在转录水平上,细胞通过加强脂类代谢基因的表达、减少糖类向脂肪酸的转化、促进细胞增殖及激活NRF2介导的氧化应激反应等,最终促进了HepG2细胞的存活。
