王方
- 作品数：4 被引量：5H指数：2
- 供职机构：重庆医科大学检验医学院临床血液学教研室更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 腺病毒介导的AIF及其突变体对K562细胞凋亡的影响被引量：2
- 2015年
- 目的构建凋亡诱导因子(Ad-AIF)及其突变体的重组腺病毒(Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF),观察其对白血病K562细胞凋亡的影响。方法扩增AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF片段,分别克隆至p Ad-TrackCMV-HA质粒中,经过PCR、双酶切和测序鉴定后,分别与p Ad-Easy1质粒重组得到腺病毒质粒,经包装和扩增后得到腺病毒,以无外源序列的腺病毒作为空载腺病毒。Western blot验证重组腺病毒在K562细胞中的表达,免疫共沉淀检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF是否与HSP70相结合,Hoechst33258染色和流式细胞术检测AIF、DMLS-AIF和DHBD-AIF对K562细胞凋亡的影响。结果重组腺病毒构建成功,能够在K562细胞中表达;AIF和DMLS-AIF与HSP70相结合,DHBD-AIF不结合HSP70;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞染色质凝集,而Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF处理的K562细胞染色质分布均匀;Ad-DHBD-AIF引起K562细胞凋亡数明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF(P<0.05)。结论成功构建了腺病毒Ad-AIF、Ad-DMLS-AIF和Ad-DHBD-AIF,其中Ad-DHBD-AIF对K562细胞的凋亡影响明显高于Ad-AIF和Ad-DMLS-AIF,为K562细胞凋亡受阻的进一步研究奠定了基础。
- 代安亚王方冯文莉
- 关键词：凋亡诱导因子细胞凋亡腺病毒载体K562细胞
- Trx-DMLS-AIF融合蛋白的原核表达及其对白血病K562细胞脱细胞系统的影响
- 2015年
- 目的 :原核表达硫氧化还原蛋白-缺线粒体定位信号的凋亡诱导因子融合蛋白(thioredoxin-apoptosis-inducing factor-defected mitochondria localization sign,Trx-DMLS-AIF),并观察其对白血病K562细胞脱细胞系统的影响。方法 :构建表达融合蛋白Trx-DMLS-AIF的重组载体并将其转化至大肠埃希菌BL21中,应用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导融合蛋白Trx-DMLS-AIF的表达,并进行Ni-NAT柱亲和层析法纯化。建立白血病K562细胞的脱细胞系统,应用吖啶橙染色法观察Trx-DMLS-AIF对白血病K562细胞脱细胞系统的影响;免疫荧光染色法观察K562细胞质蛋白对Trx-DMLS-AIF进入细胞核的影响。结果 :IPTG成功诱导融合蛋白Trx-DMLS-AIF的表达,并获得纯化的Trx-DMLS-AIF蛋白。吖啶橙染色后发现,Trx-DMLS-AIF能够诱导脱细胞系统K562细胞核凋亡;免疫荧光染色后发现,K562细胞质蛋白可阻止Trx-DMLS-AIF蛋白进入细胞核。结论 :成功诱导融合蛋白Trx-DMLS-AIF的表达。Trx-DMLS-AIF可引起K562细胞核凋亡,K562细胞质蛋白可阻止Trx-DMLS-AIF进入细胞核。
- 代安亚王方冯文莉
- 关键词：白血病凋亡诱导因子重组融合蛋白质类原核表达
- 重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响被引量：3
- 2011年
- 目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pme I酶切后转化pAd5F35-GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP及其突变体,Pac I酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP经PCR和western blot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35-SD-EGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD-EGFP和pAd5F35-SD-EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4×1012 pfu/ml。转染K562细胞后,Western blot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2-DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,其对BCR-ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。
- 史静胡晶肖青彭智曹唯希罗秋平王方冯文莉
- 关键词：SH2重组腺病毒
- 靶向G偶联蛋白受体87基因shRNA重组表达质粒的构建及鉴定
- 2014年
- 目的构建靶向G偶联蛋白受体(G protein-coupled receptor,GPR)87基因的shRNA重组表达质粒,并进行鉴定。方法根据NCBI基因数据库中的GPR87基因mRNA序列设计并合成3对靶向GPR87基因的shRNA,同时设阴性对照GPR87-HK序列,分别与线性化质粒pGenesil-1.1连接,构建靶向GPR87基因的shRNA重组表达质粒GPR87-1、GPR87-2、GPR87-3及GPR87-HK,在Lipofectamine 2000介导下,分别转染BIU87膀胱癌细胞,通过RTPCR和Western blot法检测各组细胞中GPR87基因mRNA转录和蛋白表达水平,并计算表达抑制率。结果 3种重组质粒经单酶切及测序鉴定,证明构建正确;转染BIU87膀胱癌细胞48 h后,镜下观察均可见绿色荧光;GPR87-1组、GPR87-2组和GPR87-3组细胞中GPR87基因和蛋白表达水平均显著低于GPR87-HK组(P<0.01),mRNA表达抑制率分别为76%、52%和50%,蛋白表达抑制率分别为90%、45%和41%。结论成功构建了靶向GPR87基因的shRNA重组表达质粒,为后续研究GPR87基因对膀胱癌细胞的增殖、凋亡及耐药的影响奠定了基础。
- 鲁力文李亚娟李会王方钟梁冯文莉
- 关键词：RNA干扰膀胱癌
