超短肽具有更好的稳定性、组织渗透性、生物相容性以及更低的免疫原性。GHK(glycyl-L-histidyl-L-lysine)和GQPR(glycyl-L-glutamyl-L-prolyl-L-arginine)具有刺激胶原蛋白产生、减缓胶原蛋白降解的作用,作为抗皱成分广泛应用于化妆品。超短肽一般都是通过固相合成方法制备,其缺陷是制备过程中大量使用有机化学试剂而造成环境负担,故本文探讨了一种设计和制备超短肽的新方法。因序列短而无法直接重组表达,文中首先构建了适用于融合表达的载体骨架pET28a-Trxm。以GHK和GQPR串联重复基因作为滚环扩增的基本单元(tandem repeat of short peptides,TRSP),反应时随机掺入5-甲基胞嘧啶获得长基因片段,然后经Acc65Ⅰ和ApaⅠ消化产生随机长度的基因。胶回收500 bp到1500 bp的DNA片段,克隆得到表达载体pET28a-Trxm-(TRSP)n并转化获得重组菌。双酶切及测序结果表明,成功构建获得串联重复数n=1、2、3、4、6、7、8、9的阳性克隆。蛋白表达结果显示,当串联重复数n=1、2、3、4、8、9时均有相应融合蛋白表达,表达水平随着重复数增加而降低。Trxm-(TRSP)1表达水平最高,达总蛋白的50%,而Trxm-(TRSP)2表达水平为总蛋白的30%。进一步地,含Trxm-(TRSP)1的清液先后经肠激酶和胰蛋白酶切割后,HPLC分析结果表明,成功获得超短肽GHK和GQPR。该结果对于超短肽重组制备的工业化应用具有重要价值。
