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利用反向遗传学技术构建H5N9重组流感病毒株被引量：1: 2017年; 目的利用反向遗传学技术构建来源人感染禽流感病毒H5N1和H7N9HA和NA基因的H5N9亚型禽流感病毒。方法全基因合成A／Beijing／01／2003（H5N1）禽流感病毒HA基因片段和A／Zhejiang／DTID-ZJU10／2013（H7N9）禽流感病毒NA基因片段，插入到pHW2000载体，与携带有AfPuertoRico／8／34（H1N1）的6个内部基因的pHW2000重组质粒一起转染293T和MDCK混合细胞，拯救H5N9重组病毒。结果核酸测序、HA和NA基因转录和表达检测、细胞病变分析确定利用该反向遗传学系统可以成功拯救H5N9病毒。重组H5N9病毒在MDCK细胞上复制增殖能力低于相同方法拯救H1N1病毒。结论利用反向遗传学技术成功构建一株H5N9重组病毒。; 郭磊宁若彤王晶晶郑惠文李嘉祺范海涛李洪哲杨泽宁刘龙丁; 关键词：反向遗传技术甲型流感病毒

CXCL4基因敲除小鼠的饲养、繁殖及基因型鉴定: 2016年; 目的饲养、繁殖并鉴定CXC趋化因子配体4[chemokine(C-X-C motif)ligand 4,CXCL4]基因敲除小鼠,为深入研究CXCL4的生物学功能奠定基础。方法将引进的杂合子小鼠进行饲养并繁殖,剪取繁殖成功的子代小鼠耳朵,提取其基因组DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型;比较野生型小鼠和CXCL4敲除的纯合子小鼠的体重变化及结直肠的长度,通过HE染色观察野生型小鼠和CXCL4敲除的纯合子小鼠的结直肠形态结构;采用ELISA法验证CXCL4野生型和纯合子小鼠血清中CXCL4的表达。结果繁殖成功的子代小鼠有3种基因型:野生型、杂合子及纯合子;4、10周龄雌性纯合子小鼠体重明显重于同龄的野生型小鼠(P<0.05),6、10周龄雄性纯合子小鼠体重明显重于同龄的野生型小鼠(P<0.05);6周龄雌性纯合子小鼠结直肠长度明显长于同周龄的野生型小鼠(P<0.05),但结直肠的形态结构无显著改变;纯合子小鼠血清中CXCL4的表达量明显低于WT小鼠(P<0.05)。结论成功获得了CXCL4基因敲除纯合子小鼠,为深入研究CXCL4的生物学功能奠定了基础。; 宋杰胡云光胡雅洁王艳翠李嘉祺刘龙丁; 关键词：基因敲除小鼠基因型

基于重组荧光病毒的流式细胞术检测抗CV-A16中和抗体的研究被引量：1: 2020年; 建立基于重组荧光病毒CV-A16-EGFP的流式快速测定CV-A16感染或免疫动物血清中和抗体效价的方法。在Vero细胞上对不同感染时间点,不同病毒接种量情况下的CV-A16-EGFP病毒的增殖特性进行分析;随后,利用流式检测不同病毒滴度下的EGFP阳性细胞数量、EGFP阳性细胞百分比(%)、及EGFP阳性细胞的平均荧光密度值,并换算出不同病毒滴度与三者之间分别的数值对应关系。最后,以平均荧光密度值作为替代判断病毒病变效应的指标,并利用流式荧光检测及传统微量中和方法对CV-A16感染恒河猴血清及CV-A16免疫的羊血清中和抗体效价进行检测,并对两种方法的检测结果进行比较。在感染后24h,不同的病毒滴度与对应的平均荧光密度值呈良好的线性关系。利用流式荧光检测的CV-A16中和抗体效价与传统的微量中和实验相比,两者检测结果具有较好的线性相关性,线性回归系数为R^2=0.8026;传统的微量中和实验检测的平均中和抗体效价略高于流式荧光检测的中和抗体效价,但是差异无统计学意义(P>0.05)。利用流式荧光检测可以迅速检测CV-A16中和抗体效价,并且实验结果与传统的微量中和实验具有较好的一致性。相比与传统方法,该方法更简单、快速、灵敏,为CV-A16抗血清的中和抗体检测提供参考。; 郑惠文候东佩李嘉祺李嘉祺杨谨溪刘龙丁; 关键词：柯萨奇病毒A组16型

CXCL5基因敲除小鼠的繁殖、基因型鉴定及与野生型小鼠的比较被引量：1: 2016年; 目的繁殖和鉴定CXC趋化因子配体5（CXCchemokineligand5，CxcL5）基因敲除小鼠，以获得CXCL5-／-纯合子小鼠并与野生型小鼠进行比较。方法将CXCL5＋/-杂合子小鼠繁殖后，剪取子代小鼠耳组织，提取基因组DNA，用PCR法鉴定子代小鼠的基因型。采用独立样本t检验比较同周龄同性别CXCL5基因敲除纯合子小鼠与野生型小鼠的体重和结直肠长度，并通过苏木素-伊红染色观察两种基因型小鼠的结肠形态结构。结果经繁殖，共获得60只CXCL5-/-纯合子小鼠和55只野生型小鼠。4、6、8、10周龄雌性CXCL5-/-小鼠的体重分别为（10．08±0．78）、（14．55±0．92）、（18．01±0．68）和（19．75±1．23）g，明显轻于同龄雌性野生型小鼠[（11．43±0．85）、（18．42±0．76）、（20．42±1．63）和（21．27±1．66）g]（t值分别为-2．622、-7．253、-3．042、-1．644，P值均〈0．05）；6、8周龄雄性CXCL5-／-小鼠的体重分别为（17．46±0．74）和（20．62±1．62）g，也明显轻于同龄雄性野生型小鼠[（20．47±1．66）和（23．33±1．67）g]（t值分别为-3．688、-2．885，P值均〈0．05）。6周龄雌性CXCL5-／-小鼠的结直肠长度为（6．86±0．17）cm，与同龄雌性野生型小鼠（7．66±0．11）cm的长度相比，明显较短（t=-8．835，P〈0．05），但结肠的形态结构无明显改变。结论成功获得了CXCL5基因敲除纯合子小鼠，为深入研究CXCL5的生物学功能奠定了基础。; 宋杰胡雅洁胡云光李嘉祺王艳翠刘龙丁; 关键词：基因敲除小鼠繁殖基因型

细胞自噬对甲型流感病毒H1 N1感染A549细胞过程中病毒复制及Ⅰ型干扰素表达的影响被引量：3: 2017年; 目的通过研究细胞自噬在甲型流感病毒H1 N1感染细胞过程中对病毒复制及Ⅰ型干扰素表达的影响,为进一步阐明流感病毒感染机制提供实验资料.方法利用自噬抑制剂三甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）抑制细胞自噬,流式细胞术检测3-MA对细胞凋亡的影响,激光共聚焦显微镜观察H1N1感染A549细胞后的自噬现象,利用real-time PCR检测自噬被抑制前后病毒拷贝数的变化以及Ⅰ型干扰素（typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ）产生通路各基因mRNA表达量的变化.分析细胞自噬对病毒复制及干扰素表达的影响.结果当H1N1感染A549细胞后可诱导细胞产生不完全自噬,导致自噬体积累.当自噬被3-MA抑制后,TLR3-TLR7-MyD88-IRF7-IFN-α/β信号通路各基因mRNA表达量上调,与此同时病毒拷贝数及血凝滴度下调.结论 H1N1可能通过诱导不完全自噬逃逸了机体的抗病毒固有免疫应答,促进了自身复制和存活.; 李嘉祺胡雅洁宋杰李洪哲王晶晶郭磊郑惠文宁若彤范海涛杨泽宁刘龙丁; 关键词：细胞自噬甲型流感病毒

表达趋化因子配体13的重组A组16型柯萨奇病毒的构建: 2019年; 柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)是小核糖核酸病毒科肠道病毒属病毒,是手足口病(Hand,foot and mouse disease,HFMD)的主要病原体之一。CV-A16在世界范围内广泛流行,但目前还没有有效预防CV-A16感染的疫苗上市,CV-A16疫苗的研发仍处于实验室研究阶段。本研究从改善CV-A16诱导体液免疫能力的角度出发,利用反向遗传学手段构建共表达趋化因子配体13的重组A组16型柯萨奇病毒(Coxsackievirus A16-Chemokine(C-X-C motif)ligand 13,CV-A16-CXCL13)。首先利用全基因合成方法设计合成MluⅠ-T7-5'UTR-CXCL13-VP4-VP2-NdeⅠ片段,将该片段插入pCR-XL-TOPO-CV-A16载体中,获得pCR-XL-TOPO-CV-A16-CXCL13克隆载体。将该载体线性化,体外转录出重组病毒RNA并转染细胞,最终获得包装成功的CV-A16-CXCL13重组病毒。使用PCR检测到病毒感染细胞后趋化因子配体13(Chemokine (C-X-C motif) ligand 13,CXCL13)及结构蛋白VP1在基因水平的表达;免疫印记及免疫荧光结果检测到(CXCL13与VP1蛋白水平的表达;电镜结果显示重组病毒为直径20～30nm球状颗粒;增殖曲线显示重组病毒能够在细胞中正常复制。本研究成功构建了CV-A16-CXCL13病毒,为CV-A16感染特征的研究和疫苗研发提供参考。; 黄星宋杰李嘉祺郑惠文李洪哲李恒郭磊刘龙丁; 关键词：重组病毒反向遗传学

EV-A71和CV-A16感染正常人呼吸道上皮细胞诱导差异性IFN-I产生通路相关基因表达的研究被引量：5: 2016年; 手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种全球性的传染病,其主要病原体为肠道病毒A组71型(Enterovirus group A 71,EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(cosackievirus A 16,CV-A16)。EV-A71感染易引发重症病例及死亡病例,而CV-A16感染所致的症状普遍较轻,且CV-A16容易引发重复感染,但目前其中的机理仍不清楚。本研究比较了EV-A71与CV-A16感染正常人呼吸道上皮细胞16HBE后I型干扰素(Type I interferon,IFN-Ι)产生相关基因的改变。结果发现EV-A71感染后TLR3、TLR7、RIG-I、MDA5、MAVS、MyD88、IRF3、IRF7、IFNα和IFNβ的基因表达量均发生了显著性地上调,而在CV-A16感染后仅MDA5显著性上调;TLR3和IRF3的基因表达水平显著性地下降,而其它基因表达水平均无显著性地变化。此外,病毒滴度和病毒拷贝数的检测结果显示,CV-A16在16HBE上的复制效率明显高于EV-A71。上述结果提示我们EV-A71和CV-A16感染16HBE对其IFN-I产生相关基因表达的影响完全不一样,且CV-A16更容易感染人呼吸道上皮细胞。本研究为EV-A71和CV-A16引起的临床症状差异的机理研究以及CV-A16重复感染的机理研究提供了线索。; 宋杰胡雅洁李嘉祺王晶晶郭磊郑惠文宁若彤王丽春李琦涵刘龙丁; 关键词：呼吸道上皮细胞

肠道病毒-D68型流行株3C和3D蛋白结构域序列和结构特征比较分析被引量：1: 2018年; 目的利用生物信息学的方法,探究不同亚型肠道病毒-D68型（EV-D68）的3C和3D非结构蛋白序列及结构是否存在差异.方法通过将近年来世界各国EV-D68流行株（主要为中国株和美国株）的VP1核酸序列进行比对,利用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树进行分型,选取各型的代表株,利用其3C和3D蛋白的核酸序列构建进化树并同时利用其氨基酸序列进行同源建模,以进行蛋白质结构分析.结果通过分析发现,EV-D68 Clade A、CladeB亚型毒株3D蛋白的三级结构均相同;而在3C蛋白的三级结构中,Clade B1亚型的毒株与Clade A、Clade B2和CladeB3亚型毒株存在差异.结论 3C蛋白的三级结构上的差异可能导致EV-D68 Clade B1亚型毒株的毒力和致病性高于Clade A、Clade B2和Clade B3亚型毒株.; 杨泽宁郑惠文李嘉祺李洪哲郭磊王晶晶李恒宁若彤范海涛黄星储曼曼刘龙丁; 关键词：病毒非结构蛋白质类基因

柯萨奇病毒A组16型cDNA感染性克隆的构建被引量：1: 2018年; 目的构建柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CA16)c DNA感染性克隆。方法提取CA16基因组RNA,经RT-PCR得到基因组全长c DNA,插入至TOPO-XL-PCR载体,获得CA16全长c DNA克隆。采用T7聚合酶系统将线性基因组c DNA体外转录出病毒基因组RNA,纯化后转染Vero细胞,获得拯救病毒。通过RT-PCR、基因测序及免疫荧光法对拯救病毒进行鉴定,并对拯救病毒与母本病毒的增殖特性进行比较。结果病毒基因组RNA转染Vero细胞后48 h,可见典型的肠道病毒致细胞病变。拯救病毒经RT-PCR、基因测序和免疫荧光鉴定为CA16,且与母本野生型病毒增殖特性基本一致。结论成功构建了具有感染性的CA16全长c DNA克隆,为研究CA16基因功能和研发CA16新型疫苗奠定了基础。; 李嘉祺李洪哲郑惠文宁若彤范海涛杨泽宁胡雅洁刘龙丁; 关键词：柯萨奇病毒A组16型感染性克隆病毒拯救

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