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MicroRNA-29b过表达慢病毒载体的构建及其生物学特性的研究被引量：1: 2017年; 目的:构建针对小鼠microRNA-29b过表达的慢病毒载体,研究其在小鼠神经元GT1-7细胞系中的生物学特性。方法:化学合成两条寡聚核苷酸单链,通过搭桥互补延伸成DNA双链,形成miR-29b的前体结构,将酶切后的慢病毒载体FUGW通过同源重组的方法与miR-29b的前体结构进行连接,构建相应microRNA-29b过表达慢病毒载体,并包装成病毒颗粒后转染小鼠神经元细胞系GT1-7,通过博来霉素药物筛选获得稳转株,RT-PCR检测相关基因在mRNA转录水平上表达量情况。结果:测序图谱证实重组慢病毒表达质粒f-F-miR-29b构建成功,GT1-7细胞稳转株中,miR-29b的表达量与对照组相比提高了约28倍,其靶基因DCX,Vdac1,Pten的表达量有所抑制,性发育相关基因LH-β,kiss-1,Inshulin,IGF-I,GPR54,GnRH,leptin-R没有明显变化。结论:利用慢病毒筛选的方法,成功在小鼠神经元GT1-7细胞中获得microRNA-29b过表达稳转株,为以后microRNA-29b的生物学特性的研究奠定了基础。; 李文文曲妍佳肖君华李凯周宇荀; 关键词：靶基因

一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法: 本发明涉及一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，所述表征方法为手工热启动法、热变性时间法、最低循环数法、多重PCR法以及热变性时间与多重PCR法结合。本发明的热启动Taq酶，解决了使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性...; 周宇荀李晓宁林天音王斯佳李文文肖君华李凯; 文献传递

MicroRNA-29与小鼠性发育调控相关的功能研究: 背景:Micro RNAs(miRNAs)是一组进化上高度保守的内源性非编码小RNA,长约215个核苷酸,能通过靶向结合并断裂目的m RNA或抑制m RNA的蛋白质翻译来调控生物学的进程。据报道人类所有的背景:Micro...; 李文文; 关键词：MICRORNA 慢病毒靶基因; 文献传递

一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法: 本发明涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。构建方法包括：构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9...; 周宇荀李晓宁王斯佳李文文肖君华李凯; 文献传递

一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1...; 周宇荀李晓宁李文文王斯佳肖君华李凯; 文献传递

一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法: 本发明涉及一种对GT1-7细胞进行基因编辑的方法，包括：将GT1-7细胞铺于24孔板中；待细胞贴壁生长，将含有Cas9基因和嘌呤霉素抗性基因的42229质粒转染进入GT1-7细胞系；待细胞表达嘌呤霉素基因，用嘌呤霉素筛选...; 王斯佳周宇荀邓倩云李晓宁李文文肖君华李凯; 文献传递

一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法: 本发明涉及一种用于研究Kiss1基因表达调控的报告系统及其构建方法，所述系统为红色荧光蛋白稳定表达，绿色荧光受Kiss1表达调控元件调控的双荧光Kiss1基因表达调控报告系统。构建方法包括：构建红色荧光蛋白打靶载体Ai9...; 周宇荀李晓宁王斯佳李文文肖君华李凯; 文献传递

利用基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7细胞中进行基因敲除被引量：1: 2016年; 目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型。方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变。然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后利用实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测。结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50%左右(P<0.05)。此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75%左右(P<0.05)。结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型。; 王斯佳李晓宁李文文李凯肖君华周宇荀

一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法: 本发明涉及一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，将待串联的n个sgRNA分别插入相应的42230载体；通过PCR扩增，扩增出sgRNA2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个sgRNA1...; 周宇荀李晓宁李文文王斯佳肖君华李凯; 文献传递

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李文文