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NKAIN2真核表达载体的构建与表达鉴定: 2016年; 目的 NKAIN2基因位于6号染色体长臂,6号染色体长臂的缺失现象经常发生于各种肿瘤。现构建候选抑癌基因NKAIN2真核表达载体,使其在前列腺癌细胞22RV1中过表达并观察其细胞定位,为进一步功能研究奠定实验基础。方法采用PCR方法扩增NKAIN2基因序列,将其重组于pc DNA4载体中,利用PCR和DNA测序鉴定克隆正确性;并转染到22RV1细胞,Western blot检测其蛋白表达,免疫荧光检测其在细胞中的定位。结果重组质粒中插入正确目的片段,片段大小为627 bp,与预计位置相符。Western blot检测表明,在25 000处检测到目的蛋白条带,与预计大小相符,而阴性对照未检测到相应条带,说明真核表达载体成功转染细胞,并且能够瞬时表达。转染了pc DNA4-FLAG-NKAIN2质粒的22RV1细胞在Petri皿培养24 h后可测到转染的带FLAG-NKAIN2片段的蛋白表达,且过表达的蛋白主要定位于细胞膜和细胞质中。转染未带FLAG标签的pc DNA4质粒未检测到蛋白荧光信号。结论成功构建了pc DNA4-FLAG-NKAIN2真核表达载体,转染22RV1细胞后高表达,为进一步研究NKAIN2在前列腺癌中的生物行为和其发生发展的相互作用机制提供基础。; 罗飞周柏伟黄梦怡吕永杰赵善超; 关键词：抑癌基因真核细胞

SETD4在炎症反应中的作用探讨及条件性SETD4基因敲除小鼠的构建: SETD4（SET domain-containing protein 4）蛋白是课题组前期在利用蛋白质组学技术研究脓毒性休克的发生机制时发现的差异蛋白,属于SET蛋白家族中的一个成员。已有不少研究证明该家族成员参与炎性...; 黄梦怡; 关键词：基因敲除炎症反应细胞因子

基于甲基化反应系统检测SETD3甲基化组蛋白的位点: 2017年; [目的]构建pEGX-4T-1-Setd3,表达并纯化GST-SETD3蛋白;用获得的蛋白进行体外甲基化反应并鉴定其活性,建立体外甲基化反应系统。[方法]PCR扩增小鼠全长Setd3,插入到pEGX-4T-1载体获得pEGX-4T-1-Setd3质粒。将质粒转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-SETD3蛋白并进行纯化。将获得的GST-SETD3蛋白定量后进行体外组蛋白甲基化反应,用Western Blot检测GST-SETD3对组蛋白H3K4及H3K36的甲基化情况。[结果]p GEX-4T-1-Setd3质粒构建正确,纯化的GST-SETD3蛋白纯度较高;甲基化反应结果表明,用不同来源的组蛋白、反应时间、反应缓冲液及检测方法均检测不到GST-SETD3二甲基化H3K4;GSTSETD3可以二甲基化H3K36。[结论]成功表达和纯化GST-SETD3蛋白;该蛋白可以使H3K36发生二甲基化,但不能使H3K4二甲基化。成功构建体外甲基化反应系统。; 钟玙沄黄梦怡孙江黄穗李月罗海华姜勇刘靖华; 关键词：蛋白纯化甲基化反应甲基转移酶

髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠的构建与鉴定被引量：1: 2017年; 目的利用FLP/FRT、Cre/Loxp重组酶系统构建并鉴定髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为深入研究SETD4的生物学功能奠定基础。方法将引进的Setd4^(flox/+)小鼠自交,筛选出子代基因型为Setd4^(flox/flox)的小鼠;与FLP小鼠交配,得到Setd4^(fl/+/flp)小鼠;然后分别与C57BL/6小鼠交配去除FLP酶,筛选出Setd4^(fl/+)小鼠;与Lyz2-Cre小鼠交配,筛选出Setd4^(fl/+)/Lyz2-Cre小鼠;将得到的Setd^(4fl/+)和Setd4^(fl/+)/Lyz2-Cre小鼠交配,筛选出Setd4^(-/-)/Lyz2-Cre小鼠,即髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠。利用PCR技术鉴定小鼠基因型;实时荧光定量PCR技术检测小鼠腹腔巨噬细胞及肝组织中SETD4的mRNA表达水平验证敲除情况。结果髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中SETD4 mRNA水平较野生型小鼠显著降低;而在肝组织中无显著差异。结论利用FLP/FRT、Cre/Loxp系统成功构建髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为后续的功能学研究提供了动物模型。; 黄梦怡钟玙沄黄穗孙江李月王娟姜勇刘靖华; 关键词：基因敲除

SETD4基因敲除小鼠的构建及鉴定被引量：3: 2016年; 目的构建并鉴定SETD4基因敲除小鼠,为研究SETD4的生物学功能提供动物模型。方法将引进的SETD4flox/+小鼠与EIIa-Cre小鼠进行杂交繁殖,得到基因型为SETD4+/-.EIIa-Cre的小鼠;再与C57BL/6小鼠杂交去除Cre酶,获得杂合子SETD4+/-小鼠;该小鼠自交获得纯合子SETD4-/-小鼠。通过PCR法鉴定子代小鼠的基因型;RT-PCR、荧光定量PCR方法鉴定纯合子的SETD4基因敲除小鼠SETD4m RNA表达情况;HE染色观察小鼠肝、肺组织的形态学变化。结果 PCR结果表明子代小鼠的基因型符合SETD4-/-;纯合子基因敲除小鼠SETD4 m RNA水平显著低于野生型小鼠;SETD4基因敲除小鼠肝、肺组织的形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。结论本研究基于Cre/loxp系统,成功构建并鉴定了SETD4基因敲除小鼠。; 黄穗黄梦怡钟玙沄雷烨铭赵舒祺蔡军伟姜勇刘靖华; 关键词：基因敲除 CRE/LOXP系统

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黄梦怡