蒲艳
- 作品数：6 被引量：24H指数：2
- 供职机构：新疆农业大学农学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 基于PCR方法对载体pBluescript Ⅱ SK(＋)及pCAMB Ⅰ A1300的定点突变被引量：1
- 2016年
- 运用PCR定点突变技术对载体p BluescriptⅡSK(+)以及植物表达载体p CAMBⅠA1300多克隆位点内相关的酶切位点进行改造,为运用CRISPR/Cas9基因编辑载体在构建敲除体系时提供更多便捷可用的酶切位点。通过酶切鉴定以及测序表明,成功将p BluescriptⅡSK(+)载体多克隆位点内XhoⅠ、EcoRⅤ、SmaⅠ、SacⅡ4个酶切位点,分别改造为NheⅠ、MfeⅠ、NsiⅠ、PacⅠ;将p CAMBⅠA1300植物表达载体多克隆位点内的SacⅠ、SalⅠ以2个酶切位点分别改造为NsiⅠ、PacⅠ,为今后构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体及对植物功能基因进行精准定位研究奠定一定的理论基础。
- 蒲艳刘超林琪李继洋刘晓东
- 关键词：定点突变PCR
- 棉花U3和U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定被引量：2
- 2019年
- 【目的】对已克隆的海岛棉U3和U6启动子进行功能鉴定,为构建棉花CRISPR/Cas9多位点基因编辑技术体系提供更多可用的U3和U6启动子。【方法】分别构建以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子驱动sg RNA,以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,然后在新海16的棉花叶片原生质体中进行功能鉴定。通过Polymerase chain reaction方法富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段,并利用PEG瞬时转化法将核心片段转入原生质体中。提取转化后的原生质体基因组DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突变情况并测序验证。最后绘制靶基因突变的频率分布图来计算该CRISPR/Cas9系统的编辑效率和确认突变的真实性。【结果】靶基因测序结果显示靶标位点序列突变的类型全部为碱基替换。【结论】以GbU3-2P和GbU6-7P为启动子的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花GGB基因的序列,引起基因突变。
- 藏旭阳代培红李继洋蒲艳顾爱星刘晓东
- 关键词：棉花原生质体
- 番茄不同截短U3启动子的克隆及功能分析被引量：1
- 2019年
- 从中蔬四号番茄品种中克隆能在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为今后利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行分子育种奠定了基础。采用2轮PCR的方法,第1轮PCR从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3启动子,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,并分别构建6个截短的SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片。运用DNAMAN软件对已克隆的SlU3和拟南芥AtU3启动子序列具有转录功能的必要元件进行序列分析;经过2轮PCR,首先从中蔬四号番茄品种中克隆了3种SlU3-1P、SlU3-3P、SlU3-4P启动子,其长度分别是1 156,1 114,1 147 bp,再采用Transfer PCR方法分别对3个启动子进行截短,共得到6个不同长度的启动子,其长度依次是489,318,450,248,457,248 bp,并分别构建6个截短SlU3启动子驱动GUS融合植物表达载体,启动子序列比对分析发现,番茄U3启动子与拟南芥U3启动子一样,也含有比较保守的2个元件,USE和TATA框,2个元件之间的位置比较固定。利用农杆菌转化法分别转染番茄叶片,结果显示,成功侵染后的番茄叶片均被染成蓝色,表明已克隆的6种不同截短番茄SlU3启动子均具有转录活性。成功克隆了6种在番茄叶片中高效转录的SlU3启动子,为构建番茄CRISPR/Cas9基因编辑载体提供更多高效的内源启动子。
- 蒲艳刘晓东阿尔祖古丽.塔什魏倩刘超
- 关键词：番茄克隆农杆菌转化番茄叶片
- 番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立被引量：15
- 2018年
- 【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sg RNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sg RNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sg RNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因
- 蒲艳刘超李继洋阿尔祖古丽.塔什胡燕刘晓东
- 关键词：克隆番茄
- 一种海岛棉U6启动子在CRISPR/Cas9基因组编辑体系中的功能鉴定被引量：2
- 2018年
- U6启动子是CRISPR/Cas9基因编辑系统的重要元件之一。本研究以实验室已克隆的海岛棉U6启动子构建GbU6-1P启动子驱动sgRNA,构建以抗旱负调控基因GGB为靶序列的CRISPR/Cas9基因编辑载体,转入棉花‘新海16号’原生质体中,进行功能鉴定。经酶切实验验证、测序、数据统计等确认GbU6-1P启动子在基因编辑系统中的效果。结果表明,以GbU6-1P启动子构建的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以成功地定点编辑棉花内源靶基因GGB,引起基因突变,突变率为34.5%,突变类型全部为碱基替换。
- 藏旭阳代培红李继洋蒲艳刘晓东顾爱星
- 关键词：棉花原生质体
- 棉花不同GbU6启动子截短克隆及功能鉴定被引量：10
- 2016年
- U6启动子是CRISPR/Cas9基因组编辑载体系统中驱动sgRNA转录的重要元件,而使用较短序列的启动子也是构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的基本要求之一。将已经克隆的海岛棉GbU6-5P启动子(长度为1166 bp),采用Transfer PCR方法成功地截出6个长度不同的U6启动子,其长度分别为672、468、358、280、202和105 bp,并分别构建了6个启动子驱动的GUS融合植物表达载体。将构建好的6个GbU6-5Ps::GUS-pCAMBIA1300与初始克隆的GbU6-5P::GUS-pCAMBIA1300植物表达载体一起利用农杆菌真空渗透转化法分别转染棉花花粉。GUS组织化学染色显示,克隆到的7个不同截短大小的GbU6-5P启动子均能驱动GUS基因在棉花花粉中转录,棉花花粉被染成蓝色但颜色深浅存在显著差异。结果显示启动子长度越短,其转录活性越高。而且另外两种棉花U6启动子GbU6-1P和GbU6-7P也表现出类似的结果。本研究克隆了3个短小的、在棉花花粉细胞中具有转录功能的GbU6启动子。结果显示更短的U6启动子具有更高的转录活性,而且这一特点在不同U6启动子上具有共性。这预示着使用更短U6启动子不仅符合构建CRISPR/Cas9基因组编辑载体的要求,而且会提高sgRNA的转录水平,进而可能提高基因组编辑效率。
- 雷建峰李月徐新霞阿尔祖古丽.塔什蒲艳张巨松刘晓东
- 关键词：棉花真空渗透棉花花粉
