张利华
- 作品数：9 被引量：23H指数：3
- 供职机构：教育部更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省科技支撑计划项目中央高校基本科研业务费专项资金更多>>
- 相关领域：生物学化学工程轻工技术与工程冶金工程更多>>
- 利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母基因敲除系统被引量：14
- 2014年
- 热带假丝酵母(Candida tropicalis)在发酵工业中具有重要的应用潜力,但二倍体遗传结构和较低的遗传转化效率限制了其代谢工程育种技术的应用。建立可靠的遗传转化技术并高效的删除目的基因是代谢工程改造热带假丝酵母的重要前提。文章以C.tropicalis ATCC 20336为出发菌株,通过化学诱变筛选获得了尿嘧啶缺陷型突变株C.tropicalis XZX(ura3/ura3)。以丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因作为靶基因构建了两端包含同源臂并在选择性标记C.tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase,乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶)基因两侧同向插入源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的hisG序列的基因敲除盒PDC1-hisG-URA3-hisGPDC1(PHUHP),并转化宿主菌株C.tropicalis XZX,筛选获得PHUHP片段正确整合到染色体的PDC基因位点的转化子XZX02。在此基础上,将转化子XZX02涂布于5-FOA(5-氟乳清酸)选择培养基上,筛选得到URA3基因从PHUHP片段中丢失的营养缺陷型菌株XZX03。进一步构建了第2个PDC等位基因的删除表达盒PDCmURA3-PDCm,并转化C.tropicalis XZX03菌株,获得转化子C.tropicalis XZX04。经PCR和DNA测序确认转化子C.tropicalis XZX04细胞染色体上的两个PDC等位基因被成功敲除。文章建立了一种营养缺陷型标记可重复使用的热带假丝酵母遗传转化技术,利用该技术成功敲除了细胞的PDC基因,为进一步利用代谢工程改造热带假丝酵母奠定了基础。
- 项峥陈献忠张利华沈微樊游陆茂林
- 关键词：热带假丝酵母同源重组基因敲除
- 亚铁离子对锌电积的影响被引量：1
- 2023年
- 铁是湿法炼锌原料中含量较高且难脱除的杂质之一,硫酸锌电积液中的Fe^(2+)是电积工艺过程中重点关注的有害杂质之一。以含Fe^(2+)的硫酸锌模拟溶液为研究对象,开展锌电积的工艺试验,系统研究Fe^(2+)浓度、电流密度、极间距和电积时间对锌电积电流效率、电能消耗和电积锌形貌等的影响规律。结果表明,当电积液Fe^(2+)浓度在6 mg/L以上时,将会引起电流效率严重下降及吨锌电耗显著增加,并使阴极锌反溶;在电积液Fe^(2+)浓度为6 mg/L时,优化的工艺参数条件为:电流密度400 A/m^(2)、极间距4 cm、电积时间少于16 h,在此条件下,电流效率超过90%,吨锌电耗低于2950 kWh,同时阴极锌表面较为光滑平整。
- 杨四齐夏先禹张利华张利华姚浩
- 关键词：锌电积电流效率电能消耗
- 热带假丝酵母肉毒碱乙酰基转移酶基因的删除及功能鉴定被引量：4
- 2018年
- 缺乏高效基因删除技术是限制热带假丝酵母菌株代谢工程育种的重要因素。论文发展了一种新型的基因删除技术并利用该技术成功删除了肉毒碱乙酰基转移酶的两个等位基因。首先PCR扩增标记基因(URA3)的3'端324 bp序列作为基因删除辅助序列(gda序列),同向插入到URA3基因的5'端,在此基础上构建两端含有CAT基因同源臂序列的基因删除突变盒,转化宿主菌XZX,获得CAT基因单拷贝和双拷贝敲除的突变株。PCR鉴定和DNA测序结果表明,获得的URA3基因弹出后的突变株,仅在基因组重组位点上残留一个gda序列。进一步鉴定了突变株的生理性能,单拷贝敲除菌株CAT活性较亲本下降80%,但在葡萄糖或烷烃上的生长性能并不受显著影响。双拷贝缺失菌株CAT活性完全丧失,不能利用烷烃生长,同时在葡萄糖培养基中的生长受到显著影响,最终生物量达到7.56(OD600),仅为出发菌株的57.8%。
- 张利华陈献忠陈振沈微沈微
- 关键词：热带假丝酵母基因敲除
- 酿酒酵母产脂肪酸乙酯代谢途径改造
- 2022年
- 脂肪酸乙酯(fatty acid ethyl ester,FAEE)是目前最具有潜力的新型能源,微生物细胞工厂生产FAEE比目前普遍的化学合成方法具有诸多优势,例如对环境污染小、生产成本低等。酿酒酵母具备良好的产乙醇和脂肪酰辅酶A的能力,我们试图通过改造酿酒酵母代谢途径来提高FAEE的前体——脂肪酰辅酶A的产量。通过引入根据酿酒酵母密码子优化的外源基因WS2(蜡酯合成酶基因)构建一条可以利用葡萄糖为底物、经过一系列反应生成FAEE的代谢通路。富集脂肪酰辅酶A需要进一步改造分支途径,例如阻断甾醇酯途径(ΔARE1、ΔARE2),三酰基甘油途径(ΔDGA1,ΔLRO1)和β氧化途径(ΔPXA2)来减少脂肪酰辅酶A的分流,从而相应的富集脂肪酰辅酶A。结果表明:3个途径的敲除大大增加了FAEE的产量,相较于在原始出发菌株BY4741中表达WS2即菌株BYW2增加了9倍,摇瓶产量达到11.72 mg/L。由于目的产物FAEE产量较低,在摇瓶发酵阶段进行了发酵优化,对是否添加乙醇和菜籽油、发酵时间以及乙醇添加模式这3个因素进行优化。结果表明:添加乙醇和菜籽油明显提升了FAEE产量,最佳发酵时间为60 h,乙醇添加模式为从20 h开始每间隔6 h补加发酵体积的2%,此时FAEE产量达到最高,为144.4 mg/L,是未优化前FAEE产量的12.3倍,是出发菌株BY4741中FAEE产量的480倍。为进一步提升FAEE产量,采用发酵罐发酵并对比了尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2和尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE产量的差异,结果显示尿嘧啶缺陷菌株BYD5W2的FAEE最高产量为0.618 g/L,尿嘧啶未缺陷菌株BYD5W2*的FAEE最高产量为1.35 g/L,是目前报道的利用酿酒酵母产FAEE产量中较高的。
- 姜慧张利华夏媛媛陈献忠
- 关键词：酿酒酵母基因敲除基因整合
- 代谢工程改造大肠杆菌生产乳酸的研究进展被引量：4
- 2017年
- 乳酸是自然界中最小的手性分子,广泛应用于食品、医药和化工等领域,同时也是合成生物可降解塑料——聚乳酸的前体。目前,化学合成法和微生物发酵法是生产乳酸的两种主要方法,而后者在底物的可再生性、产物光学纯度和环境友好等方面均具有潜在优势。自然界中许多微生物细胞都能合成和积累乳酸,如大肠杆菌、酿酒酵母和乳酸菌等。与乳酸菌、芽胞乳杆菌和谷氨酸棒状杆菌等乳酸生产菌株相比,大肠杆菌具有生长速度快、营养要求简单、易于高密度发酵、代谢网络清楚、遗传操作方法成熟和产物乳酸光学纯度高等优势。本文中,笔者介绍了乳酸的研究现状及其在工业生产领域中的作用,系统综述了国内外通过代谢工程改造大肠杆菌生产乳酸的研究进展,在此基础上展望了乳酸生产研究的发展方向,以期为其工业应用提供参考。
- 张利华陈献忠沈微樊游
- 关键词：大肠杆菌乳酸代谢工程细胞工厂
- 热带假丝酵母磷酸甘油酸激酶基因启动子功能鉴定
- 2020年
- 热带假丝酵母是重要的工业生产菌株,但表达系统还不完善导致代谢工程育种手段受到限制。探索新的表达元件对热带假丝酵母的基因工程育种十分重要。本文通过多重序列比对从热带假丝酵母ATCC 20336基因组中扩增得到一个具有较高活性的磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)启动子,以酵母增强型绿色荧光蛋白(yeGFP3)作为报告基因,整合到热带假丝酵母基因组上并对其表达活性进行研究。通过分离300、550、750 bp和846 bp4个长度的启动子片段分别表达yeGFP3,转化XZX宿主菌获得P-1、P-2、P-3和P-4共4个转化子。荧光显微镜结果表明,随着启动子长度的截短,荧光逐渐减弱,前3个转化子的相对荧光强度分别为P-4的4.98%、9.84%和48.4%。同时分析了4个转化子的yeGFP3转录水平,转录水平分别为P-4的5.6%、13.8%和60%。初步判断PGK1启动子至少存在2个上游激活序列(UAS)。
- 周静雨陈献忠张利华张利华沈微
- 关键词：热带假丝酵母启动子绿色荧光蛋白
- 代谢改造热带假丝酵母发酵木糖母液生产木糖醇被引量：3
- 2017年
- 木糖醇是一种在食品、医药、轻工等领域具有广泛用途的多元醇,目前主要通过酸水解木聚糖获得木糖并进一步化学催化加氢方法制备。提取木糖过程中会产生大量的木糖母液副产物,其中含有一定浓度的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等碳源,以及少量的糠醛、四氢呋喃等物质。研究微生物转化木糖母液生产高附加值化学品不仅能够提高木糖母液的利用价值,而且能够减少环境污染。热带假丝酵母不仅能够利用葡萄糖,也具有高效的木糖代谢途径。首先利用代谢工程技术删除了热带假丝酵母菌株的木糖醇脱氢酶基因,获得能够转化木糖积累木糖醇的突变株。在此基础上,评价了突变株在木糖母液培养基中的发酵性能。通过单因素优化实验确定了突变株发酵生产木糖醇较优的发酵工艺:培养基组成为木糖母液300g/L,玉米浆5g/L;最佳发酵条件为:发酵温度35℃,初始p H为5.0,接种量15%,200r/min摇床培养140h。利用优化后的发酵工艺,木糖醇产量达到83.01g/L。初步建立了转化木糖母液生产木糖醇的工艺,为进一步利用木糖母液奠定了基础。
- 陈振陈献忠张利华王均华沈微樊游
- 关键词：热带假丝酵母木糖醇木糖母液基因删除发酵
- 不同温度Fe-H_(2)O体系的溶解组分优势区域图和Pourbaix图
- 2023年
- 针对Fe-H_(2)O体系中重要的单核配合物进行计算分析,通过热力学手册获得各反应物质S_(298K)^(0)、ΔG_(298K)^(0)和C_(P)^(0)的数据,计算得到不同温度下的ΔG_(T)^(0)的数据,分别构建298、373、473、573 K温度下的溶解组分优势区域图和Pourbaix图。结果表明,Fe^(2+)和Fe^(3+)均可稳定存在于强酸性溶液中。随着溶液pH值的升高,Fe^(2+)依次转化为FeOH^(+)、Fe(OH)^(+)和Fe(OH)_(3)^(-),而Fe^(3+)依次转化为FeOH^(2+)、Fe(OH)_(2)^(+)、Fe(OH)_(3)0和Fe(OH)_(4)^(-)。在高电势区域,Fe^(2+)被氧化成Fe^(3+),并进一步被氧化成FeO_(4)^(2-)。随着温度的升高,溶液中Fe^(2+)和Fe^(3+)的稳定存在区域向酸性方向偏移而减少。通过控制体系电位和pH值条件,可以使铁以FeOOH/Fe_(2)O_(3)的形式沉淀。随着温度升高到373 K及以上,碱性条件下,Fe(OH)_(4)^(-)的优势区域出现,造成单质Fe的腐蚀。随着温度的升高,以固相形态存在的Fe、FeOOH/Fe_(2)O_(3)、Fe_(3)O_(4)稳定区域逐渐减少,液相区域不断扩大,特别是Fe_(2)O_(3)的固相区域减少明显。因此,热力学上,温度越高,对Fe金属的防腐及溶液中铁的沉淀越不利。
- 杨四齐夏先禹张利华张利华姚浩
- 关键词：热力学
- pH值对臭氧氧化深度去除湿法炼锌溶液中铁的影响
- 2021年
- 铁是湿法炼锌过程中的有害杂质成分,必须在锌电积前深度去除。研究了在臭氧氧化条件下,pH值对ZnSO4溶液中除铁性能的影响。结果表明,铁的去除率和锌的损失率随pH值的升高而增大,在pH值为4.5时,铁去除率达到99.98%,渣中Zn和Fe含量分别为1.52%和34.61%,沉淀渣主要是由FeOOH和ZnSO_(4)·xH_(2)O组成。随着pH值的增加,铁沉淀物颗粒趋于团聚,粒径显著增大,沉淀的可过滤性提高。锌通过包裹在沉淀物的晶格中或被沉淀物所吸附而损失在铁沉淀物中。臭氧氧化过程中,Fe^(3+)/Fe^(2+)值及臭氧消耗量随pH值的增加而增加,从而导致ZnSO4溶液的电位值减小。
- 张佳乐王天张利华张利华张利华
- 关键词：湿法炼锌臭氧氧化除铁PH值
