- 肠道病毒71型不同病毒株3D蛋白对细胞损伤的作用
- 2017年
- 目的 比较肠道病毒71型（EV71）SDLY11株和SDLY107株3D蛋白对细胞的损伤程度.方法 EV71病毒株SDLY11和SDLY107分别取自轻症手足口病患儿和重症手足口病患儿.反转录PCR扩增目的基因11-3D-Flag和107-3D-Flag,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.1中,连接产物转化至大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切和测序鉴定.重组质粒转染人横纹肌肉瘤（RD）细胞,间接免疫荧光试验和蛋白质印迹检测3D蛋白表达,乳酸脱氢酶（LDH）检测3D蛋白导致的细胞损伤,噻唑蓝（MTT）比色法测定3D蛋白对细胞增殖的影响,Annexin-V/Pl双染法测定3D蛋白引起的细胞凋亡.各组间两两比较方差齐采用LSD-t检验,方差不齐采用Dunnett T3检验.结果 反转录PCR扩增获得1 400 bp片段,酶切鉴定重组质粒后分别获得1 400 bp和5 400 bp片段,测定序列与目的基因一致.间接免疫荧光试验观察到特异性荧光,蛋白质印迹显示目的蛋白相对分子质量为55×10^3.LDH结果显示SDLY11株3D蛋白转染组的吸光度（A）490值高于SDLY107株3D蛋白转染组,分别为0.790±0.048和0.641±0.018,差异有统计学意义（t=5.14,P〈0.05）,SDLY11株3D蛋白引起的细胞膜损伤情况较SDLY107株3D蛋白严重.MTT比色法结果显示SDLY11株3D蛋白转染组的A570值低于SDLY107株3D蛋白转染组,分别为1.028±0.020和1.081±0.002,差异有统计学意义（t=3.31,P〈0.05）,SDLY11株3D蛋白对细胞增殖活性的影响大于SDLY107株3D蛋白.Annexin-V/PI双染法结果显示,SDLY11株3D蛋白转染组和SDLY107株3D蛋白转染组的细胞凋亡百分比分别为（1.471±0.246）%和（1.465±0.237）%,差异无统计学意义（t=0.04,P=0.973）.结论 与SDLY11株3D蛋白相比,SDLY107株3D蛋白引起的细胞损伤程度较轻微,且对细胞增殖活性的影响较弱,更有利于病毒在细胞内的复制.
- 白永娟庄志超郝树彬李纯王莉鸿袁晓晶赵丽王志玉温红玲
- 关键词：细胞损伤
- 肠道病毒71型毒力候选位点的筛选及其作用机制研究
- 温红玲李纯董祯刘子薇温小菁陈锐庄志超赵丽王志玉
- 自噬与凋亡在肠道病毒感染细胞过程中的影响及其相互作用被引量：4
- 2017年
- 肠道病毒感染可引起一些严重的疾病,如脊髓灰质炎病毒感染导致急性弛缓性麻痹、柯萨奇病毒感染导致病毒性心肌炎和无菌性脑膜炎等、埃可病毒感染引起发热和无菌性脑膜炎等、肠道病毒71型感染导致心肺功能障碍和神经系统疾病等.近年来越来越多的研究发现,细胞自噬与凋亡在肠道病毒感染过程中有重要作用.本文就自噬和凋亡在肠道病毒感染过程中的影响及二者的相互作用进行综述.
- 李纯温红玲
- 关键词：肠道病毒属自噬
- 1例手足口病患者及其密切接触者的病原检测与序列分析被引量：2
- 2016年
- 目的 对山东省济宁市手足口病患者及其接触者标本进行病毒分离以及基因组序列测定与分析,捕捉病毒在传播过程中的变异情况.方法 使用RD细胞分离病毒,通过8对位于保守区的首尾重叠的全序列扩增引物进行扩增和序列的测定与拼接,并对全基因序列以及氨基酸序列与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)各亚型标准株进行同源性分析以及遗传进化分析.结果 自1例患儿及其密切接触者各分离得到1株EV71分离株,分别命名为SDJN2015-01和SDJN2015-01.1;同源性分析显示分离到的两株病毒与C4a亚型株EU703813同源性最高;遗传进化分析显示两株病毒同属于C4a亚型.序列比对发现,两株病毒共存在12个核苷酸的差异,导致6个氨基酸的差异,分别为VP1区K98E(全编码区为K663E)和A133T(A698T)以及2C区D48N(D1159N)、V126I(V1237I)、I238V(I1349V)和N314Y(N1425Y).结论 SDJN2015-01和SDJN2015-01.1株同属EV71C4a亚型,其与C4a亚型标准株EU703813具有高度同源性;两株病毒间在VP1和2C区产生的氨基酸的变异对病毒毒力以及感染能力是否有影响有待进一步研究.
- 庄志超颜丙新郝树彬姜文国白永娟李纯鲁燕赵丽王志玉
- 关键词：EV71同源性分析遗传进化分析
- 肠道病毒71型2A蛋白关键氨基酸突变对病毒毒力的影响
- 肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属的成员,基因组为单股正链RNA,主要感染5岁以内的婴幼儿。多数EV71感染表现为手足口部的疱疹、皮疹和发热等症状,部分患儿会出现神经系统并...
- 李纯
- 关键词：肠道病毒71型点突变毒力细胞自噬
- 文献传递
- 肠道病毒71型3D重组病毒的拯救
- 2017年
- 目的利用反向遗传技术将肠道病毒71型(EV71)弱毒株SDLY1的3D蛋白置换入强毒株SDLY107,拯救重组病毒,为EV71 3D蛋白的研究提供操作平台。方法利用重叠PCR的方法得到3D编码区的重组片段,T-A克隆插入p MDl9-T载体。通过双酶切、T4连接将其置换到含有SDLY107株全长的质粒p MD19-T-107中。体外转录获得感染性RNA,转染Vero细胞,盲传3代得到重组病毒SDLY 107(1-3D),通过PCR和q RT-PCR对重组病毒进行鉴定。结果 PCR扩增得到大小为600、1 400和200 bp的3D区及其左右片段;重叠PCR扩增得到大小为2 100 bp的1-3D片段;双酶切鉴定重组质粒得到大小为7 400和2 700 bp的片段,测序结果证实3D区置换成功;感染性RNA转染Vero细胞后,接种至第3代时观察到细胞皱缩变圆,折光性增强;PCR鉴定重组病毒得到大小为226 bp的片段;q RT-PCR检测到细胞中病毒量于24 h开始缓慢增加,48 h后快速增多,至72 h后病毒量不再增长。结论成功拯救了重组病毒SDLY107(1-3D),为进一步研究3D蛋白的毒力和其在EV71致病机制中的作用提供基础。
- 白永娟庄志超郝树彬王莉鸿李纯鲁燕赵丽王志玉温红玲
- 关键词：肠道病毒71型重组病毒
