刘丹
- 作品数：2 被引量：14H指数：2
- 供职机构：北京蛋白质组研究中心更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家科技重大专项更多>>
- 相关领域：理学医药卫生更多>>
- 全柱成像毛细管等电聚焦电泳分析蛋白质药物电荷异质性被引量：9
- 2017年
- 评价了cIEF-WCID检测多肽与蛋白质药物等电点的应用效果。测定标准多肽的等电点,验证了cIEF-WCID具有高的准确度和良好的重复性(相对标准偏差<0.50%)。人血红蛋白的4种主要异构体实现了基线分离;甘赖胰岛素的重复测试均只检出单一特征峰(p I 5.95±0.01);比较重组人生长激素原液和成品,等电点特征峰比例差异明显,且成品有新特征峰出现;对比进口及国产贝伐单抗,发现厂家1、3与原研药基本一致,厂家1的主成分迁移规律与原研药高度一致,厂家2的重链C末端K缺失、N末端焦谷氨酸环化或脱酰胺修饰影响了电荷异质性;通过考察尿素浓度、电解质范围和聚焦时间,优化了检测重组人促卵泡素等电点条件:2 mol/L尿素,两性电解质pH 2.5~5.0与pH 3.0~10.0按1∶1混合,聚焦电压1 000 V(1 min)~1 800 V(4 min)~2 200 V(1 min)。cIEF-WCID可快速、准确测定具有电荷异质性的蛋白类药物等电点,分辨率和重复性好,尤其是可以跟踪聚焦过程中样本的迁移特征,特别适合蛋白类药物复杂电荷异质性的检测。
- 孟晓光甄里刘悦玫侯利平刘丹李斌欧阳伟民魏开华
- 关键词：抗体药学研究
- 具创新分子结构的更优长效性重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的表达、制备和特性研究被引量：5
- 2017年
- 目的研究作为药物级别重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白的生产制备工艺;开展详尽的融合蛋白理化特性研究;提出作为长效创新药物的质量基础和技术指标。方法利用基因工程技术构建1个能稳定表达全新分子结构和更优长效性的重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(rH SA/EPO)的基因工程CHO细胞株;研究建立悬浮、无血清培养基,批次化、可线性放大的规模化生产工艺,并就分离纯化的融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的r HSA/EPO蛋白质单体纯度达到97%以上;经不同作用位点蛋白酶水解的r HSA/EPO产物通过MALDI-TOF/TOF质谱肽质量指纹谱和Nano LC-MS/MS液质联用串联质谱检测得到总序列覆盖率100%;N-端氨基酸序列前15个氨基酸与理论序列相符;rH SA/EPO为糖基化蛋白,定位了糖基化位点;原液中融合蛋白的质谱分子量测定值为93 k D;酶深度脱糖后的质谱分子量测定结果为84205 D,与理论分子量84849.52 D值相近;融合蛋白含有1个自由巯基,表明仅有1个游离半胱氨酸存在;经圆二色光谱分析比对表明,HSA和EPO各自的空间二级构象未变;毛细管电泳测定有多个电荷异构体范围在pI 5.1~5.8,等电聚焦获得的等电点值(p I)约为p I 4.9;紫外光谱呈现典型蛋白质光谱特征;原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA的残留量均符合药物原料药的要求。免疫学鉴别为阳性;小鼠体内生物比活性测定结果值为0.9×105 IU/mg;体外UT7细胞法与小鼠体内生物活性测定较大差异,但体内与体外生物活性测定方法可用于不同试验目的,且相互间也具有一定的相关系数。结论理化特性研究获得较为全面的药学数据,其结果可作为指导"注射用重组人血清白蛋白/促红素融合蛋白(CHO细胞)"原料药的质量标准和制造检定规程的基础,并显示出原创的r HSA/EPO(之间无连接肽)具有创新性,符合作为药物的更优分子结
- 富岩杨小楠魏开华富俞淞云文琦郑博崴刘丹于在林
- 关键词：白蛋白类CHO细胞重组融合蛋白质类
