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张正茂: 作品数：35 被引量：125H指数：7; 供职机构：华中科技大学同济医学院基础医学院更多>>; 发文基金：国家自然科学基金国家科技重大专项国家重点基础研究发展计划更多>>; 相关领域：医药卫生农业科学生物学更多>>

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噬菌体phi29 pRNA载体在RNA干扰中的初步应用研究: 2007年; Gene-silencing siRNA has shown great promise for the treatment of genetic diseases,cancers,and viral infections,but its therapeutic value has been hindered by the lack of an efficient and safe in vivo delivery system to target specific cells.The motor pRNA of phi29 has a strong tendency to form dimers,trimers and hexamers by interaction of interlocking right and left hand loops.This unique feature makes pRNA an ideal vector for the delivery of multiple therapeutic RNAs.Toxicity of pRNA was detected by transfection of 8 pRNA in HeLa cells.A pRNA-based vector was designed to carry siRNAs to inhibit GFP or HBV surface gene expression.Silence effects on siRNA against expression of GFP or HBV surface gene were detected in HeLa cells.Viral replicative intermediates were detected by Southern blotting.The results of toxicity study showed there was no toxicity of pRNA to cultured monolayer cells.The siRNA connected with pRNA can inhibit GFP or HBV surface gene expression in HeLa cells and inhibit HBV replication in HepG2 cells.These data suggest that pRNA can be used as a vector for imparting stability to siRNA in vitro.; 田拥军张正茂杨燕覃莉孟忠吉刘慎沛杨东亮; 关键词：噬菌体 PRNA RNA干扰乙型肝炎病毒

人ISG20基因的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究: 2006年; 目的:克隆、体外真核表达ISG20基因并研究其抗乙肝病毒效应。方法:应用RT-PCR的方法从Hela细胞中扩增ISG20基因,构建HA-ISG20融合蛋白真核表达载体(pHA-ISG20),分别转染HepG2和HepG2·2·15细胞。Western blot检测HA-ISG20融合蛋白在HepG2细胞中的表达;ELISA方法检测转染和未转染pHA-ISG20的HepG2·2·15细胞中HBs抗原和HBe抗原的表达情况。结果:①克隆了ISG20基因,经测序与Genebank公布序列一致;②HA-ISG20融合蛋白真核表达载体经转染可在HepG2细胞中瞬时表达;③HA-ISG20融合蛋白可抑制HepG2·2·15细胞中HBs抗原和HBe抗原的表达。结论:初步证实ISG20蛋白产物可能具有抗HBV的效应。; 郝友华叶笛张正茂杨东亮; 关键词：克隆真核表达

乙型肝炎表面抗原主要亲水区Ⅱ的抗原性被引量：2: 2007年; 目的研究HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸变异对HBsAg抗原性的影响。方法定点突变HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸对应的s基因（P120T、C121S、K122I和T123N），构建4个真核表达重组质粒。用重组质粒和表达G145RHBsAg质粒体外瞬时转染HepG2细胞。4种抗体和7种国产HBsAgELISA诊断试剂盒检测转染细胞上清液和细胞裂解液中变异HBsAg的免疫反应性，免疫荧光检测单克隆抗体与转染细胞内变异HBsAg的免疫反应性。结果成功构建了表达HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸变异的重组质粒，P120T、C121S、K122I和T123N变异HBsAg的免疫反应性比野生HBsAg低，T123N变异导致HBsAg存在分泌障碍。结论HBsAg主要亲水区Ⅱ的4个氨基酸对维持HBsAg的空间构象和抗原性具有重要作用。; 田拥军张正茂夏昶刘慎沛余源黄红平杨燕陆蒙吉杨东亮; 关键词：乙型抗原性

pRNA介导的RNA干扰抑制HBV表达和复制的研究被引量：4: 2006年; 为了研究由pRNA携带的siRNA(HBVsi18-42)所介导的RNAi过程能有效地抑制HBV的基因表达和病毒复制,我们利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价HBVsi18-42对HBV复制和基因表达的抑制作用。通过Western印迹检测细胞内的HBsAg含量,用ELISA检测细胞培养上清和小鼠血清中的HBsAg水平,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,通过免疫组织化学检测肝组织切片中HBcAg的表达情况。试验结果显示,HBVsi18-42能以剂量依赖的方式在293T细胞中抑制HBsAg的表达以及在HepG2细胞中下调病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平。在小鼠模型中,注射后的3d内HBVsi18-42使小鼠血清中HBsAg的水平分别下降了98.98%、77.07%和60.73%,免疫组织化学检测显示,在注射后的第3天小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了79.1%。初步结果显示HBVsi18-42无论是在细胞或是在小鼠模型中都能下调HBV的复制和基因的表达。本研究为我们下一步实现由pRNA介导的靶向RNAi及基因治疗提供了理论和技术支持。; 张正茂田拥军杨燕王宝菊郭培宣杨东亮; 关键词：RNA干扰 PRNA 乙型肝炎病毒

抑制α/β干扰素受体α亚基表达的pSUPER-H1 RNAi系统构建及功能初步鉴定: 2008年; 樊和斌王宝菊李磊郝友华张正茂杨燕杨东亮; 关键词：PSUPER Β干扰素亚基表达 RNAI 受体Α

带有6肽组氨酸的HBV S/S145真核表达载体的构建及应用: 2008年; 目的构建稳定表达带有6肽组氨酸的HBVS/S145蛋白的真核载体。方法应用PCR技术及体外基因重组技术,将S基因和nt587突变的S基因插入带有his-tag的pxF2RH载体中,扩增6个组氨酸和S/S145基因,最后与经NheI、SalI双酶切的线性载体pCI-neo连接,构建成带有6肽组氨酸的稳定表达S/S145的真核表达载体(简称pCI-his-S Y/S145)。用脂质体转染的方法将质粒转至人宫颈癌细胞,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中抗原的分泌情况。用West-ern-blot方法检测细胞中外膜蛋白的表达情况。结果真核表达载体pCI-his-SY/S145的测序结果与预期大小一致。ELISA方法可检测到细胞上清中的野生型表面抗原,但检测到145突变抗原表达水平低。应用Western-blot方法可以同时检测到野生型和G145R突变的外膜蛋白表达。结论带有his-tag的重组质粒pCI-his-S/S145可以在Hela细胞中成功表达融合蛋白,且组氨酸可作为检测蛋白的标志。; 覃莉田拥军张正茂郝友华王宝菊杨东亮; 关键词：乙型肝炎病毒

14株抗乙型肝炎表面抗原单克隆抗体与变异表面抗原的反应模式及应用: 2007年; 目的制备抗乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）的单克隆抗体，检测单克隆抗体与15种变异HBsAg的反应模式。用筛选出的单抗建立快速检测变异HBsAg的ELISA实验方法，并做初步评价。方法用中国乙型肝炎病毒感染者血清中分离的HBsAg免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤细胞融合技术制备抗．HBs单克隆抗体。检测不同单克隆抗体与野生及变异HBsAg的反应性。筛选出两种可以较好识别变异HBsAg的单克隆抗体McAb2和McAb3，建立两种抗体ELISA检测HBsAg的方法。结果制备了14株抗-HBs单抗。经过初筛，有4种可以较好识别包括G145R在内的大多数变异HBsAg。优化了McAb2和McAb3检测HBsAg的条件，检测HBsAg的灵敏度较好，检测变异HBs舷的能力优于2种现行国产HBsAg检测试剂盒。结论用本实验制备的单抗可以很好地识别包括G145R在内的大多数变异HBsAg。; 田拥军张振华张正茂李磊覃莉龚劲松杨东亮陆蒙吉; 关键词：乙型肝炎病毒乙型肝炎表面抗原单克隆抗体

生物素化sH-2K^d-HBc复合物单体的构建及纯化被引量：1: 2006年; 目的构建及纯化生物素化的sH-2Kd-HBc复合物。方法以原核表达的sH-2Kd-BSP为重链,β2m为轻链,分别纯化后与H-2Kd限制性9肽(HBc131~139)在体外采用稀释法进行共折叠复性,然后在B irA酶作用下,对折叠产物进行生物素化,形成了生物素化的H-2Kd-HBc复合物。通过凝胶过滤层析法进一步纯化生物素化的复合物单体。结果原核表达质粒pET-H-2Kd-BSP的测序结果与GenBank所公布的序列一致。利用辣根过氧化物酶标记的亲和素对折叠复性及生物素化后的复合物进行检测,证明成功获得了生物素化的sH-2Kd-HBc复合物。结论获得了纯化的生物素化sH-2Kd-HBc复合物单体,为进一步在体外构建sH-2Kd-抗原肽四聚体及制备人工抗原提呈细胞,深入研究HBV感染过程中特异性CTL应答和效应机制奠定了基础。; 宋娜郝友华张正茂吴珺杨新星丁红晖杨东亮; 关键词：免疫应答

带有6肽组氨酸的HBV S／S145变异蛋白真核表达载体的构建及应用: 目的本课题旨在构建稳定表达带有抗原表位标记(6肽组氨酸)的乙型肝炎病毒表面抗原(野生／145变异)的真核载体。从而为检测、纯化蛋白(变异)奠定基础。方法应用PCR技术及体外基因重组技术,将S基因和nt587突变的S基因插...; 覃莉田拥军张正茂杨东亮; 文献传递

sH-2K^d肽复合物的构建及多克隆抗体的制备: 2007年; 目的构建可溶性的H-2Kd肽复合物,并制备抗MHC-Ⅰ(H-2Kd)分子多克隆抗体。方法原核高效表达的sH-2Kd-BSP和β2 m蛋白,在抗原肽(乙型肝炎病毒的核心蛋白HBc131-139)的存在下,体外复性折叠成可溶性的H-2Kd-β2m-抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体。应用纯化的该复合物单体免疫C57BL/6小鼠制备多克隆抗体。结果①Western blot检测显示获得了生物素化的sH-2Kd-HBc复合物单体。②Western blot检测显示抗MHC-Ⅰ(H-2Kd)分子多克隆抗体与复合物单体有很好的抗原抗体反应;Balb/C小鼠脾脏冰冻切片的免疫组化结果:在细胞膜表面见棕色着色。③Dot-ELISA检测该多克隆抗体的滴度可以达到1∶3 200。结论成功构建了具有完整构象的生物素化sH-2Kd-HBc复合物单体,制备了抗MHC-Ⅰ(H-2Kd)分子多克隆抗体。; 杨新星郝友华张正茂宋娜杨东亮; 关键词：多克隆抗体

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