刘国强
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
- 供职机构：江南大学生物工程学院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点基础研究发展计划中央高校基本科研业务费专项资金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程更多>>
- 包含ARS/CEN元件的游离质粒在巴斯德毕赤酵母中的稳定性研究
- 2020年
- 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是应用最为广泛的外源蛋白表达系统之一。目前使用最多的外源蛋白表达策略是使用整合型质粒;游离型质粒由于其高不稳定性,在毕赤酵母中的应用受到极大的限制。将ARS/CEN等元件连接到pPIC9K载体上,构建能够自主复制的游离型质粒pPIC9K-ARS/CEN,通过传代培养检测质粒丢失的方法探究毕赤酵母在细胞传代培养过程中游离质粒的稳定性。无选择压力情况下,包含ARS/CEN元件的游离质粒在细胞培养10代之前具有极高的稳定性,随后游离质粒开始丢失,到第20代质粒丢失率高达92.94%。该研究结果为构建稳定的游离质粒毕赤酵母表达系统提供了良好的支撑,并提供了切实可行的质粒消除方法,为毕赤酵母运用CRISPR/Cas9系统进行多基因编辑提供了良好的研究基础。
- 刘国强孙文浩张晴业周金凯白仲虎刘秀霞杨艳坤
- 关键词：巴斯德毕赤酵母质粒稳定性
- 降低诱导温度对改善猪α-干扰素发酵生产性能和ATP再生效率的作用被引量：4
- 2011年
- 在10 L发酵罐、控制甲醇浓度的条件下,考察了诱导温度对毕赤酵母发酵生产猪α-干扰素(pIFN-α)性能的影响。结果表明,温度对pIFN-α表达的影响明显,20℃低温有利于pIFN-α的表达,该条件下pIFN-α最高活性可达1.5×106IU·ml-1,是30℃传统诱导生产时最高活性(1.0×104 IU·ml-1)的150倍。发酵状态参数的在线测量和代谢分析结果表明,20℃低温诱导环境下,细胞代谢活性高、甲醇比消耗速度(0.036 h-1)比30℃时的(0.021 h-1)大;同时,低温诱导下的CO2释放速度(CER)和呼吸商(RQ)均较低,表明改变诱导温度可以改变胞内代谢流的分配。更重要的是,低温诱导既可以增加目标蛋白表达支路的碳代谢流,又可以提高甲醇能量代谢支路中产生的NADH利用效率、改善毕赤酵母生产pIFN-α系统的ATP再生效率和速度,实现了目标蛋白的高效表达。
- 刘国强金虎高敏杰戴科科汪汇慧李震史仲平
- 关键词：毕赤酵母
- 巴斯德毕赤酵母甘油转运体的发现及功能研究被引量：3
- 2017年
- 目的:分离确认巴斯德毕赤酵母中甘油转运体并初步研究其功能。方法:通过生物信息学方法从NCBI数据库中查找可能的甘油转运体(gt1,GeneID:8197545),并通过DAS软件对其跨膜结构域进行预测。通过PCR方法扩增该基因并将其与EGFP融合克隆到pPICZ B及pRS424载体进行亚细胞定位;同时将其与pRS424载体连接后电转到粟酒裂殖酵母中进行异源表达确定其功能;通过同源重组敲除gt1基因并在不同培养基中培养测定aox1基因表达量。结果:生物信息学显示与酿酒酵母中已经证明的甘油转运体(sugar transporter 1,stl1)类似,GT1蛋白同样为具有疏水结构域的跨膜蛋白,同时亚细胞定位结果显示GT1蛋白定位于细胞膜上,包含有gt1基因的粟酒裂殖酵母可以在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长而野生型不可以;在Δgt1突变体中aox1基因可以获得组成型表达。结论:分离并确认了巴斯德毕赤酵母中的甘油转运体GT1,并初步证明其与aox1基因甘油阻遏相关。
- 战春君李翔刘国强刘秀霞杨艳坤白仲虎
- 关键词：巴斯德毕赤酵母亚细胞定位同源重组
