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家蚕JAB1/CSN5蛋白的基因克隆表达及亚细胞定位被引量：4: 2009年; JAB1/CSN5是COP9信号复合体(constitutive photomorphogenic signalosome CSN)的第5个亚基,内嵌的JAMM基序是CSN参与蛋白的泛素化降解途径并调控生物体生长发育过程的异构酶活性位点。在家蚕蛹cDNA文库中筛选到的一条基因序列,其ORF长度为1047 bp,预测编码蛋白含有JAB1/CSN5保守结构域JAB-MPN,因此命名为BmJM。将BmJM基因的ORF插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmJM,于E.coliRosetta菌中进行原核表达,重组蛋白以包涵体形式存在。以纯化后的重组蛋白为抗原免疫大白兔获得BmJM的多克隆抗体,采用RT-PCR、Western blotting方法对BmJM基因在家蚕不同发育时期和组织中的转录及蛋白表达水平进行分析,发现BmJM蛋白在家蚕5龄幼虫的生殖腺表达量最高,而在其他组织中表达量较少,由此初步揭示了JAB1/CSN5在家蚕生长发育过程中的作用。亚细胞定位测定表明BmJM蛋白在细胞质近核区域含量最高,在细胞核中也有分布。; 许红姚斐盛清吕正兵陈健聂作明王丹刘立丽沈红丹舒建洪舒特俊陈剑清吴祥甫张耀洲; 关键词：家蚕基因克隆荧光定量PCR 亚细胞定位

家蚕富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白基因BmSPARC的表达及亚细胞定位被引量：1: 2009年; 富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC)是一种小分子酸性糖蛋白,在有机体内广泛分布,通过与胞外基质蛋白相互作用而表现出多种生物活性。从家蚕蛹cDNA文库中获得SPARC基因(BmSPARC)的cDNA序列,GenBank登录号为FJ602783。利用生物信息学方法对此序列进行分析表明,BmSPARC的cDNA序列全长1 626 bp,含有1个954 bp的开放阅读框(ORF),编码317个氨基酸残基;同源性比较显示该基因编码蛋白的氨基酸序列在无脊椎动物中具有较高的保守性。将BmSPARC片段在大肠杆菌BL21中表达并纯化后,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,通过亚细胞定位研究发现该基因表达蛋白主要存在于细胞质中。利用实时荧光定量PCR的方法,对BmSPARC在家蚕不同发育时期、不同组织中的mRNA转录水平进行比较,并采用Western blotting方法对BmSPARC蛋白的表达进行分析,结果表明:BmSPARC在家蚕卵期和5龄幼虫丝腺组织中无表达,而在5龄幼虫、蛹、蛾发育时期及5龄幼虫的头部、脂肪体、中肠、马氏管、卵巢、表皮和气门等7个组织中均有不同程度的表达,其中在蛾期和5龄幼虫卵巢中的表达量较高。研究结果为进一步探讨BmSPARC在家蚕生长发育过程中的生物学功能打下了基础。; 朱玉娟吕正兵陈琴聂作明王丹陈健刘立丽郑青亮陈剑清沈红丹盛清全滟平徐杰张文平吴祥甫张耀洲; 关键词：家蚕亚细胞定位实时荧光定量PCR

家蚕脂质运载蛋白基因BmLip32的特征与表达活性分析: 2009年; 从已构建的家蚕蛹期cDNA文库中筛选得到一条新的cDNA片断,经生物信息学分析发现其编码框具有脂质运载蛋白(lipocalin)保守结构域,命名为BmLip32基因,GenBank登录号为FJ602775。构建融合表达质粒pET-28a-BmLip32后转化大肠杆菌BL21并诱导表达,将纯化的His-BmLip32融合蛋白免疫新西兰大白兔成功制备多克隆抗体,效价大于1∶12 800。RT-PCR检测结果表明BmLip32在家蚕蛹期转录水平最高,在5龄幼虫头部中的转录水平明显高于其它组织。Western blotting分析结果显示BmLip32在5龄幼虫头部大量表达。免疫细胞化学实验显示BmLip32蛋白存在于家蚕Bm5细胞的细胞质中。推测BmLip32基因是家蚕神经系统发育相关的重要调控基因。; 牛伟涛李珊珊聂作明陈健吕正兵王丹吴燕吴怡高攀于威盛清沈红丹张耀洲; 关键词：家蚕表达活性实时荧光定量PCR 免疫印迹免疫细胞化学

家蚕一种富含半胱氨酸蛋白基因BmCRP的原核表达与定位研究: 2009年; 从家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经生物信息学分析显示该cDNA序列全长1 011 bp,包括5′-UTR 200 bp和3-′UTR 136 bp,编码224个氨基酸,其编码蛋白质的N-端富含半胱氨酸,将该基因命名为BmCRP(基因登录号:DN985186.1)。该基因编码蛋白主要有α螺旋、β-折叠、无规则卷曲3种二级结构,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点等5种功能位点。构建重组表达载体pET-28 a(+)-BmCRP并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得融合蛋白,用纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体与BmCRP有较好的特异性。W estern b lotting检测结果:BmCRP蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在5龄幼虫的表皮、头部、卵巢、睾丸、马氏管中均有表达。荧光定量RT-PCR检测结果:BmCRPmRNA在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾的整个生命周期中,其转录水平呈增加趋势;在5龄幼虫不同组织中的转录水平从高到低依次为表皮、头部、生殖腺、中肠、马氏管、气管、丝腺和脂肪体。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均存在,细胞核中的荧光信号比细胞质中的信号强。研究结果有助于进一步探明家蚕BmCRP蛋白的结构和功能。; 陈世慧张文平盛清吕正兵陈健聂作明王丹刘丽丽沈红丹舒建洪陈剑清吴祥甫张耀洲; 关键词：家蚕基因组结构细胞定位实时荧光定量PCR

家蚕脂围蛋白(PLIN)基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究: 2009年; 脂围蛋白(perilipin)与脂肪细胞脂类代谢的调节有关。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条cDNA开放阅读框(ORF)序列长度为918 bp的基因,预测其编码305个氨基酸残基,蛋白分子质量约32.5 kD。经NCBI比对发现该蛋白具有部分脂围蛋白的保守结构域,因此将该ORF序列命名为BmPLIN基因。将该基因插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmPLIN,并转化大肠杆菌中进行原核表达得到带有His标签的融合蛋白,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。用纯化后的融合蛋白为抗原免疫大白兔获得多克隆抗体,ELISA间接法测定抗体的效价达到1∶12 800以上。通过荧光定量PCR和Western blotting技术对BmPLIN基因及其编码蛋白在家蚕5龄幼虫各个组织器官中的转录、表达水平进行分析的结果是:BmPLIN基因mRNA在家蚕5龄幼虫各组织器官中的转录水平由高到低依次为生殖腺(卵巢和睾丸)、脂肪体、肠、表皮、头部、马氏管、丝腺、气门,在家蚕5龄幼虫的生殖腺(卵巢和睾丸)中有明显的BmPLIN蛋白特异条带。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞实验的结果显示,BmPLIN蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。; 姚斐许红舒特俊盛清吕正兵陈健聂作明王丹刘立丽沈红丹舒建洪陈剑清吴祥甫张耀洲; 关键词：家蚕蛋白纯化亚细胞定位

家蚕泛肽-核糖体蛋白S27a的表达及功能研究被引量：8: 2007年; 泛肽(UB)-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)是泛肽和核糖体蛋白的融合蛋白,在真核细胞中表达时,被酶解成UB和核糖体蛋白S27a(RPS27a)。从家蚕蛹cDNA文库中获得了该基因并原核表达了该蛋白,命名为BmUBRPS27a。将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,通过亚细胞免疫荧光定位发现该蛋白存在于细胞核和细胞质。用荧光定量PCR对该蛋白在家蚕中的表达作了初步分析,发现RPS27a在活性增殖细胞中表达量很高。将合成了BmUBRPS27a的dsRNA进行RNAi,用脂质体转染家蚕卵巢上皮细胞Bm5后,细胞的形态发生了变化:细胞由圆形、椭圆形变成了梭形,甚至出现类似神经细胞的突触结构。该基因对维持细胞正常形态具有重要的作用。; 叶嘉良陈健吕正兵聂作明王丹王雪冬沈红丹吴祥甫张耀洲; 关键词：家蚕肿瘤细胞定位荧光定量PCR RNA干扰

家蚕小热休克蛋白基因BmHSP20.8的表达及功能研究被引量：2: 2009年; 小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)是一类受热处理后诱导产生的蛋白家族。从构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了一条全长764 bp的基因序列(GenBank登录号:AAG30944.1),其开放阅读框(ORF)长561 bp,编码186个氨基酸。用生物信息学方法对此序列进行同源性分析,表明该序列是一条保守性高达85%的家蚕小热休克蛋白20.8(BmHSP20.8),无跨膜结构,主要分布于细胞质。将该序列的ORF与pET-28a(+)载体连接构建重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21进行原核表达,纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清。通过亚细胞定位技术研究BmHSP20.8在正常和热激状态下的家蚕卵巢上皮细胞Bm5和BmN中的变化,结果显示热激后BmH-SP20.8蛋白从细胞质往细胞膜方向迁移。有BmHSP20.8表达的大肠杆菌菌株经48℃处理后,其生存率比未表达BmHSP20.8蛋白的菌株高4倍左右,说明BmHSP20.8蛋白在大肠杆菌中表达能够提高细菌体在高温环境下的生存率。; 赵恩伟吕正兵盛清陈健聂作明王丹沈红丹刘立丽舒建洪陈剑清吴祥甫张耀洲; 关键词：多克隆抗体制备亚细胞定位

家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位被引量：1: 2010年; 【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为:睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。; 王帅玉盛清吕正兵陈健聂作明王丹刘立丽沈红丹舒建洪陈剑清吴祥甫张耀洲; 关键词：亚细胞定位

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沈红丹

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