李国攀
- 作品数：15 被引量：17H指数：2
- 供职机构：长江大学更多>>
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- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 副猪嗜血杆菌sodA基因的表达及其理化性质
- 2021年
- 为探究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)sodA基因编码的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性及理化性质,设计特异性引物从HPS中扩增得到目的基因sodA,利用原核表达系统对HPS SOD蛋白进行表达,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300凝胶过滤层析以及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等方法对表达蛋白进行了分离纯化,利用邻苯三酚自氧化法对纯化产物进行SOD酶活性检测,通过HPSEC法、火焰原子吸收分光光度法对其理化性质进行了初步探究。结果表明,表达的重组HPS SOD蛋白质为可溶性蛋白质,单亚基分子质量为26 ku,纯化后目的蛋白质纯度为95%,纯化后的重组HPS SOD蛋白质比活性为215.9 U/mg,经HPSEC法检测分析,重组HPS SOD呈多聚体,通过火焰原子吸收分光光度法检测纯化的重组HPS SOD中锰元素含量为0.71 mg/L。
- 胡基雄王席李国攀荣俊
- 关键词：超氧化物歧化酶邻苯三酚自氧化法
- 猪圆环病毒3型抗体的ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用
- 本发明提供了重组猪圆环病毒3型(PCV3)Cap蛋白、ELISA检测试剂盒及其制备方法与应用。该重组PCV3Cap蛋白的制备包括重组猪圆环病毒3型Cap蛋白基因的克隆及目的基因的筛选；重组猪圆环病毒3型Cap蛋白基因改造...
- 荣俊李国攀匡红艳徐保娟王席
- 文献传递
- 猪圆环病毒2b型病毒样颗粒表面可用于外源肽展示的位点分析
- 2022年
- 为了分析猪圆环病毒2b型病毒样颗粒(virus-like particles of Porcine circovirus type 2b,PCV-2b VLPs)表面具有外源肽展示潜力的位点,试验通过PyMol软件分析了PCV-2b VLPs表面的位点分布,并以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)Gp5的中和表位B(Epitope B,EpB)为外源肽,通过重叠PCR方法将表面位点替换为EpB,构建EpB嵌合的PCV-2b衣壳蛋白(Cap),利用原核表达系统诱导表达后进行凝胶层析纯化和Western-blot检测,并利用透射电子显微镜分析VLPs的组装状态。结果表明:在PCV-2b VLPs表面共筛选到8个可用于外源肽展示的位点,分别为S1(Y^(50)TIKRTTVKTP^(60))、S2(L^(75)PPGGGSN^(82))、S3(F^(124)VTKATAL^(131))、S4(V^(161)LDSTIDY^(168))、S5(Q^(183)TAGNVD^(189))、S6(I^(201)YDQE^(205))、S7(K^(222)DPPL^(226))、S8(S^(104)PITQGDRGVGS^(115))位点;将EpB替换展示到S1~S8位点后,构建的EpB嵌合的PCV-2b Cap能够在原核表达系统中获得不同程度的可溶性表达,其中S1~S7位点被EpB替换后能够实现较高水平的可溶性表达;8个目的蛋白均能被抗EpB抗体特异性识别,也均能够自组装形成VLPs,但粒径大小和形态与PCV-2b VLPs有不同程度的差异。说明试验筛选出的8个位点均有一定的外源肽展示能力。
- 李国攀荣俊谢明匡红艳
- 关键词：病毒样颗粒原核表达系统
- 一株禽腺病毒4型Fiber2蛋白单克隆抗体的制备被引量：2
- 2022年
- 制备禽腺病毒4型(FAdV-4)Fiber2蛋白的特异性单克隆抗体,将重组蛋白FAdV-4 Fiber2纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,分离脾脏中的淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,筛选得到10株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株1B5F1、1B5G11、1B5C1、1B5D2、1B5E3、1B5F3、1B5E4、1B5G4、1B5A8、1B5G8,取分泌抗体水平最高的1B5F1细胞株制备腹水,利用斑点杂交(Dot blot)和间接免疫荧光试验(IFA)进行特异性检测。结果表明,成功制备10株杂交瘤细胞株;制备的腹水能与FAdV-4 Fiber2蛋白及FAdV-4攻毒后的鸡肝组织产生特异性反应,证明成功制备了FAdV-4 Fiber2蛋白特异性单克隆抗体。
- 谢明李国攀胡基雄张志翔艾笑扬陈帝斯李杨尹俊翔荣俊
- 关键词：单克隆抗体
- 2022年湖北Ⅰ群禽腺病毒流行病学调查及分离鉴定
- 2023年
- 禽腺病毒是全球家禽常见的传染病病原之一,目前对禽腺病毒进行流行病学调查,已给全球家禽业造成了巨大的经济损失。为了调查禽腺病毒在湖北地区的流行情况,在2021~2022年从湖北市场收集了224份鸡肝样本,为FAdV疫苗研制提供参考。基因测序结果显示:其中14株携带FAdV,Hexon L1环基因序列系统发育,12株为C型,2株为D型。在鸡肝癌细胞株(LMH)中培养并分离得到FAdV-11 HB200株,对分离物的Hexon基因进行了扩增和测序。遗传进化分析表明:FAdV-11 HB200与多个FAdV-11毒株处于同一分支。FAdV-C的流行率仍然占主导地位,相关部门应采取预防FAdV感染的措施。
- 艾笑扬李杨陈帝斯李国攀荣俊
- 关键词：禽腺病毒流行病学调查系统发育分析
- 猪圆环病毒2型病毒样颗粒的纯化及鉴定被引量：9
- 2019年
- 为获得较高纯度的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)Cap蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)并对其进行结构和功能研究,本试验以大肠杆菌表达系统表达了PCV2重组Cap(PCV2 rCap)蛋白,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析、Capto Q离子交换层析、CsCl密度梯度离心等方法对其进行了纯化。通过Western blotting对纯化所得蛋白进行免疫反应性鉴定,透射电镜(TEM)观察纯化蛋白的粒径及形态,高效液相尺寸排阻色谱(HPSEC)检测其组分分布。结果显示,纯化后PCV2 rCap蛋白经SDS-PAGE检测,可见28 ku的目的蛋白带,灰度扫描法检测其纯度为97.53%。Western blotting结果显示,该处的特异性蛋白条带有明显的免疫反应性;TEM检测其为粒径17.35~19.24 nm的规则球形颗粒,表明所获得的PCV2 rCap蛋白在表达时能在菌体内自我装配成VLPs,且在纯化过程中没有被破坏而解聚,仍保持天然状态;HPSEC检测纯化样品中VLPs含量为92.67%。本试验结果为进一步研究PCV2 VLPs的空间结构及其免疫保护机制提供了参考依据。
- 王席李国攀陈清清徐保娟荣俊
- 关键词：纯化凝胶过滤层析离子交换层析
- 多杀性巴氏杆菌外源基因表达元件的构建及其序列分析
- 2015年
- 为了在多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)中高效表达外源基因,克隆了天冬酰氨合成酶A(asn A)基因的启动子Pasn A和终止子Tasn A,双酶切获取p UC18质粒的多克隆位点,将这3个片段组装成一个可以方便插入外源基因的表达元件。测序结果分析表明,Pasn A是巴氏杆菌asn A基因的强启动子,具有原核生物典型的Pribnow盒和SD序列。p UC18的多克隆位点mcs具有多个核酸限制性内切酶的单一切点,便于外源基因的插入。Tasn A是巴氏杆菌asn A基因的强终止子,具有很好的回文结构,在发卡结构后面有一段富含A/T区。3个片段表达元件(Pcms T)的构建为完整的巴氏杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒的构建奠定了基础。
- 李国攀熊萍萍荣俊
- 关键词：终止子
- 重组猪尿酸氧化酶基因突变及其对聚乙二醇化的影响
- 2021年
- 目的对重组猪尿酸氧化酶(recombinant porcine urate oxidase,r PUOX)进行突变改造,以增加rPUOX上可供聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)耦合的赖氨酸(Lys)残基数,探究PEG修饰对改造前后的酶液在SPF鸡体内的药效和抗原屏蔽作用的影响。方法对纯化的基因改造前后的r PUOX进行PEG化修饰,修饰蛋白静脉注射SPF鸡,共4次,每次间隔7 d。实验分为20×5K PEG-rPUOX-215组、20×5K PEG-rPUOX组和空白对照组(0.9%生理盐水)。于鸡翼根静脉处采血,用血糖尿酸测试仪及尿酸测试条测定尿酸浓度,酶反应-紫外分光光度法检测尿酸酶活性,间接ELISA法检测免疫原性。结果 20×5K PEG-r PUOX-215和20×5K PEG-rPUOX均获得充分修饰,且前者修饰效果更好。第1、2次注射,降低鸡血尿酸幅度20×5K PEG-rPUOX-215组高于20×5K PEG-rPUOX组约11%和6%。3次注射药效维持时间20×5K PEG-rPUOX组相较于20×5K PEG-rPUOX-215组逐次降低0、24和48 h。20×5K PEG-rPUOX-215组抗体产生速率相对较慢,且14 d抗体阳性率低于20×5K PEG-rPUOX组约14.3%。结论 20×5K PEG-rPUOX-215修饰后药效学作用更显著,药物半衰期延长,且免疫原性相对较低,为研制低免疫原性的rPUOX及实现临床上多次给药提供了新的方法和思路。
- 李欢杨玉莹李国攀王席胡基雄荣明轩荣俊
- 关键词：聚乙二醇化尿酸浓度免疫原性
- 多杀性巴氏杆菌同源重组质粒电转化条件研究
- 2015年
- 为了在多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）中高效地筛选同源重组转化子,将具有卡那霉素抗性标记的自杀质粒pBluescript-F1KanRF2通过电转化导入到多杀性巴氏杆菌R473中,探讨了同源重组电转化和筛选的一些条件。结果表明,在19kV/cm的电场强度,37.5μg/mL的DNA浓度,5%血清的营养条件、20～50μg/mL的卡那霉素浓度的条件下,可以获得较多的阳性克隆,为构建多杀性巴氏杆菌基因敲除减毒株提供技术支持。
- 李国攀荣俊
- 关键词：电转化同源重组
- 2种猪瘟疫苗对猪群的免疫效果评价
- 2016年
- 采用阻断ELISA检测血清抗体的方法对2种猪瘟疫苗的免疫效果进行了评价,结果显示:(1)猪瘟活疫苗A(脾淋源)的免疫效果与免疫剂量和次数没有明显关系;(2)猪瘟活疫苗B(细胞源)在加强免疫后2倍剂量的抗体保护率比单倍剂量更高;(3)随着免疫时间(80d内)的增加,2种试验疫苗的抗体保护率都在提高,但在一次免疫后20d内均不能达到较好的免疫保护效果。
- 朱方磊周芳芳李进李国攀荣俊熊涛
- 关键词：猪瘟疫苗免疫效果
